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研究背景:急性肺损伤(ALI)/急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是临床上较为常见的由创伤、严重感染等多种内外因素诱发的以难治性低氧血症为特征的危重症,目前认为ALI/ARDS的本质是一种炎症,其发病与炎症的失控密切相关。尽管近年来人们对ARDS的研究不断深入,诊疗技术有明显提升,其病死率仍居高不下[1-2]。因此,深入研究其发病机制,寻求新的有效的治疗靶点,开发新的药物和治疗手段,减轻过度炎症反应以降低发病率和死亡率显得尤为重要。死亡相关蛋白激酶1(DAPK1)是一种钙调蛋白(CaM)调节的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,包含有多个功能区域,作为一种凋亡正性调节因子在多种途径诱导引起的凋亡中扮演着重要角色[3-4],还参与了炎症的调节和自噬[5-6]。有研究发现,DAPK1参与了脑及肾的缺血性急性损伤疾病过程[7-8]。然而,DAPK1是否也参与急性肺损伤的发病过程,是否参与其炎症失控的调节尚未见报道。因此,本课题拟采用脂多糖(LPS)构建急性肺损伤模型及LPS诱发的巨噬细胞炎症模型,观察DAPK1的表达变化,并通过下调DAPK1表达后观察细胞自噬水平、促炎基因表达及炎症因子表达水平,从而探讨DAPK1在急性肺损伤发病及炎症调节中的作用及机制。研究目的:1.明确DAPK1在急性肺损伤时的表达及其在炎症失控中的作用;2.探讨DAPK1在控制炎症反应过程中的潜在机制。方法:1.DAPK1在急性肺损伤小鼠肺组织中的表达研究通过LPS(10mg/kg)腹腔注射构建急性肺损伤小鼠模型,采取HE染色观察肺损伤病理改变情况,免疫组化、Western blot及Real-time PCR等技术明确DAPK1在急性肺损伤小鼠肺组织中的表达变化及定位,ELISA检测血浆促炎因子水平变化。2.DAPK1对LPS诱导小鼠巨噬细胞炎症反应的调控作用及机制研究Western blot及Real-time PCR技术观察LPS作用RAW264.7巨噬细胞后,DAPK1随时间和浓度改变的表达情况;构建DAPK1 shRNA腺相关病毒,感染巨噬细胞后应用Western blot观察对NK-KB启动子活性、下游p38-mTOR信号通路、自噬相关蛋白LC3、p62的影响,Real-time PCR检测炎症因子IL-6、TNF-α和IL-1β的表达变化。3.下调DAPK1的表达对急性肺损伤炎症反应的影响采取LPS腹腔注射构建急性肺损伤模型,使用DAPK1特异性抑制剂TC-DAPK6预处理小鼠抑制DAPK1表达,Western blot检测TC-DAPK6对DAPK1的抑制效果,HE染色观察DAPK1抑制后对LPS诱导肺损伤的病理改变情况,Western blot及Real-time PCR观察DAPK1抑制后对NF-κB P65及促炎因子水平的影响,应用Kaplan-Meier生存分析研究不同处理组小鼠的生存时间。结果:1.成功构建了急性肺损伤小鼠模型,DAPK1在正常小鼠肺组织中仅少量表达,在急性肺损伤3h时DAPK1表达较对照组升高(P<0.05),至24h达到最高水平(P<0.05)。炎症因子TNF-α、IL-6急性肺损伤时较对照组表达明显升高(P<0.05),在12-24h维持在较高水平(P<0.05)。随着LPS处理时间的延长,肺湿干重比逐渐升高(P<0.05)。2.随着LPS浓度的不断升高,刺激RAW264.7巨噬细胞DAPK1表达逐渐增加(P<0.05)。在LPS刺激6h后开始上升(P<0.05),至24h达到最高水平(P<0.05),至48h表达有所下降(P<0.05)。此外,LPS处理RAW264.7细胞后,NF-κB启动子活性以及炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α的表达显著升高。通过AAV-DAPK1 shRNA转染下调巨噬细胞DAPK1表达后,NF-κB启动子活性明显下降(P<0.05),同时P38-mTOR表达受到抑制,LC3 II/I上调,而p62表达减少(P<0.05),自噬激活。此外,促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平也明显下降(P<0.05)。3.TC-DAPK6特异性抑制DAPK1表达后,小鼠肺组织病理损伤较单独LPS组明显减轻,DAPK1表达受抑制后NF-κB p65表达明显下降(P<0.05),血浆中促炎因子TNF-α、IL-6水平明显低于LPS组(p<0.05),肺湿干重比显著降低。通过Kaplan-Meier生存分析发现,DAPK1抑制后小鼠的生存期显著长于LPS组(p<0.01)。结论:1.DAPK1在LPS诱导的急性肺损伤中表达明显增加,可能参与急性肺损伤的发病。2.DAPK1通过调控P38-mTOR信号通路抑制巨噬细胞自噬以及激活NF-κB炎症信号通路,从而参与急性肺损伤的疾病过程。3.体内研究进一步证实DAPK1可通过激活NF-κB炎症信号通路,促进ARDS的发生发展。