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目的:晚期肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)患者常常面临术后高复发率、预后差的风险。尤其是晚期肝细胞癌的病人,常易出现对临床药物的抵抗,这为临床治疗带去很多困难。肝细胞癌发病存在明显的乙型肝炎相关性,而我国正是乙型肝炎的高发区域,因此对HCC发展机制的探索有助于我们找到HCC新的治疗靶点从而开发更多有效的治疗措施。外泌体是细胞分泌的小型囊泡,囊泡直径40-100nm,它包含多种生物分子,如脂类、蛋白质和核酸。外泌体是细胞通过胞吐作用所分泌的纳米级囊泡,能被靶细胞摄取,并能在局部细胞和远处细胞之间传递生物信号。外泌体广泛参与并调节细胞间基本的生理过程,如神经元通讯、抗原呈递、免疫反应、器官发育和生殖性能等。它们也参与一些病理疾病的发展,包括癌症进展、心血管疾病、炎症及神经退行性疾病。近年来,逐渐有研究发现外泌体的分泌促进了肿瘤的恶性生物学过程。同时也有许多研究致力于利用外泌体作为生物标志物、疫苗和药物载体或干预外泌体分泌,最终对疾病进行治疗干预和靶向调控。Rab蛋白是进化保守的Ras超家族中有鸟苷三磷酸酶(guanosine triphosphatase,GTPase)功能的成员,调节所有真核细胞的细胞内膜转运。研究表明Rab35是一个重要的内吞过程的分子开关,调节多种细胞内部过程,包括细胞分裂,细胞迁移和神经轴突的生长。越来越多的证据表明Rab相关蛋白参与了癌症的发展,然而其中的具体机制尚不清楚。研究发现其对维持肿瘤细胞的增殖、迁移、信号转导、外泌体分泌等多方面有调节作用。Rab35作为Rab GTPase家族成员之一,广泛参与细胞内部囊泡转运及物质运输过程,Rab35在乳腺癌、前列腺癌及肝癌肿瘤组织中异常高表达,并通过多种细胞生存信号促进肿瘤细胞侵袭转移。因此,鉴别和分辨来源不同类型细胞的外泌体对理解其信号特性至关重要。本实验的目的是为了探究Rab35是否促进了HCC的恶性形成,并且外泌体是否参与该过程的形成。研究方法:本研究通过生物信息学肿瘤基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)获取了肝细胞癌组织和癌旁组织分子表达矩阵及临床样本信息,比较癌旁组织和肿瘤组织中Rab35 mRNA的表达情况;通过Kaplan-Meier生存分析比较Rab35mRNA表达水平对患者生存预后的影响;通路富集功能分析明确Rab35参与调控肝癌细胞不同通路的趋向性。使用pcDNA3.1-Rab35/pcDNA3.1转染肝癌细胞(Huh7和HepG2)从而构建Rab35过表达细胞系及阴性对照细胞系;用CCK8实验检测过表达细胞系和阴性对照组肝癌细胞的增殖情况;采用Transwell实验检测肝癌细胞过表达Rab35后的迁移能力,并通过Transwell侵袭实验,评估Rab35过表达肝癌细胞系的侵袭能力。为明确Rab35对外泌体释放的影响,过表达Rab35后,通过超离心法分离并通过电镜(Electron microscopy,EM)和纳米颗粒跟踪分析(Nanoparticle tracking analysis,NTA)进行外泌体鉴定及分析;Western blot检测肝癌细胞源性外泌体标记蛋白(CD63和TSG101)的表达情况;并将过表达Rab35后肝癌细胞分泌的外泌体与受体细胞进行共培养,使用CCK8实验对不同处理因素下的细胞进行生长能力检测,通过Transwell实验对受体肝癌细胞的迁移和侵袭能力进行检测。为明确Rab35如何参与外泌体分泌过程,在过表达Rab35后,荧光共聚焦实验观察CD63和Rab35的细胞内部分布和定位情况。结果:与癌旁组织相比,Rab35 mRNA表达在肿瘤组织中明显上调,Rab35mRNA高表达的患者较低表达患者预后生存时间更短。差异表达基因的通路富集功能分析显示,Rab35 mRNA的高表达与细胞增殖、外基质重塑和膜的运输有关。体外实验表明,Rab35的过表达促进了肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力(P<0.05)。此外,我们发现过表达Rab35可以促进肝癌细胞的外泌体分泌(P<0.05),且分泌的外泌体有助于受体细胞的增殖、迁移和侵袭。在进一步的研究中,我们证明了过表达Rab35可以在MVB膜上诱导CD63和Rab35的共定位(P<0.05)。结论:Rab35 mRNA表达在肝细胞癌组织中增加,Rab35 mRNA的高表达与病人预后不良相关。Rab35能够通过促进MVB向质膜的转运过程从而诱导肝癌细胞外泌体的分泌,进而促进肝癌细胞的增殖能力、侵袭能力和迁移能力。我们的研究发现有望为HCC的靶向治疗提供一种新的策略。