油菜RBOHB基因的克隆及表达分析

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当植物受到生物或非生物胁迫时,NADPH氧化酶通过短时间内大量产生信号分子活性氧(ROS)调节基因表达和细胞的新陈代谢,使植物及时应对逆境胁迫作出反应,以适应环境的变化。本研究以陇油6号和天油2号两种油菜作为供试材料,以油菜RBOHB(respirator brust oxidase homolog B)为研究对象,对该基因的序列特征、生物学信息、转录水平等做了初步研究。主要结果如下:1.从陇油6号油菜中克隆得到一个新的RBOH家族基因RBOHB。该基因全长2694 bp,包含2541 bp的开放阅读框,可编码一个含846个氨基酸的蛋白质,预测蛋白分子量MW为96.7 kDa,等电点为12.66。生物信息学分析结果表明,油菜RBOHB富含α-螺旋和不规则卷曲,且为为亲水性蛋白,没有跨膜螺旋结构。2.实时荧光定量PCR实验结果表明,油菜RBOHB基因在陇油6号和天油2号两种油菜的茎、叶、下胚轴中均有表达,在表达上没有组织特异性,且叶中的表达量最高。低温、高盐、H2O2胁迫都能不同程度地诱导两种油菜RBOHB基因的表达,并且陇油6号油菜中RBOHB的转录水平明显高于天油2号油菜,说明RBOHB基因在陇油6号油菜抵御非生物胁迫的过程中发挥了作用。MAPKK抑制剂U0126预处理12 h后再分别进行低温、高盐、H2O2胁迫处理,其结果与各自单独低温、高盐、H2O2胁迫处理结果相比较,发现RBOHB基因在两种油菜中的转录水平都明显降低,但陇油6号中的表达量仍高于天油2号,说明MAPKK抑制剂U0126对天油2号油菜中RBOHB基因转录水平的抑制作用较陇油6号强。MAPKK抑制剂U0126能抑制油菜RBOHB基因的表达,表明MAPKKK→MAPKK→MAPK构成的MAP激酶信号传导途径与油菜RBOHB基因的转录水平之间存在相互作用,推测它们之间有某种正调控机制。3.经不同浓度(5mM、10 mM、15 mM、20 mM)H2O2处理后,两种油菜中APX与SOD的活性随着H2O2浓度的升高呈现先上升后下降的趋势,CAT活性和GPX则无显著变化。叶绿素含量在天油2号油菜中随着H2O2浓度的升高呈现下降的趋势,而在陇油6号油菜中则呈现的是先上升后下降的趋势,当H2O2浓度大于10mM时,两种油菜叶片叶绿素含量都有不同程度的下降,但陇油6号中的含量仍然高于天油2号。丙二醛(MDA)含量在天油2号油菜中的含量始终高于陇油6号。游离脯氨酸(Pro)的含量在天油2号中随着H2O2处理浓度的升高有明显下降的趋势,但在陇油6号油菜中的积累量明显高于天油。从上述生理指标变化的结果来看,陇油6号油菜的抗逆性强于天油2号。两种油菜中NADPH氧化酶活性均有不同水平的升高,而MAPKK抑制剂预处理再经H2O2处理后,两种油菜中NADPH氧化酶的活性较单独H2O2处理的结果,发现均有所降低,表明U0126对NADPH氧化酶的活性具有抑制作用。这与H2O2胁迫及MAPKK抑制剂预处理再逆境胁迫后,两种油菜中RBOHB基因转录水平的实时荧光定量PCR结果是一致的。
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