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梭鱼(So-juy Mullet, Mugil soiuy)是我国沿海地区重要的一咱经济实用鱼,环渤海湾的一项环境调查发现,野生梭鱼在不同地区雌雄同体的发生率最低为10%最高达到59%,远高于其它调查鱼种。梭鱼雌雄同体的发生对于该地区渔业资源造成了潜在的危胁。己有研究表明野生鱼类雌雄同体现象的发生与长期暴露在环境雌激素类物(environmental estrogens, EES)污染的环境中有关。目前己知的大多数EES是通过雌激素受体(estrogen receptor, ER)介导发挥内分泌干扰作用的,且己有证据表明,不同物种的ER对某些雌激素活性物质的结合活性存在敏感性差异。本文旨在通过建立梭鱼ERα结合物质物种特异性筛选方法,比较梭鱼ER与其它物种ER结合活性的差异,从物种ER结合差异性角度出发,解释梭鱼雌雄同体高发现象的一个可能原因。本文采用RT-PCR及RACE法,从梭鱼肝脏RNA中扩增出长1113 bp的梭鱼ERα(sERα) DEF区片段,并以此构建PGBT9- sERαLBD质粒,将其和pGAD424-TIF2质粒依次转入Y190酵母细胞中,建立了sERα物种特异性的酵母双杂交筛选系统。并在此系统用酵母活性测试方法测试了三种天然雌激素:雌酮(estrone,E1)、17β-雌二醇(17β-estradiol,E2)、雌三醇estriol,E3)和一种人工合成雌激素17α-炔雌醇(17α-ethynylestradiol,EE2),三种常见酚类物质:辛基酚(Octylphenol,OP)、壬基酚(Nonylphenol, NP)、双酚A(Bisphenol A, BPA)及两种植物雌激素:4’,5,7-三羟基异黄酮(Gensline)、玉米赤霉烯酮(Zearalenone)与梭鱼ERα结合后的诱导活性。比较了E1、E2、E3、EE2与sERα-TIF2酵母、青鳉鱼ERα- TIF2(mERα- TIF2)酵母、大鼠ERα- TIF2(rERα- TIF2)酵母结合活性的差异及上述九种物质与sERα-TIF2酵母,mERα- TIF2酵母结合活性的差异。结果如下:1.九种物质的酶诱导活性均存在明显的剂量-效应关系,所构建的双杂交酵母可用于梭鱼物种特异性环境雌激素类物质的筛选。2.E1、E2、E3、EE2与rERα和mERα结合后的诱导活性均存在显著性差异,EE2和E3与sERα和rERα结合后的诱导活性差异显著。进一步证明用哺乳动物体外雌激素受体结合活性的数据外推到其它物种存在着一定的偏差,所以有必要构建物种特异性的筛选系统。3.E1、E2、E3、EE2与sERα和mERα结合后的诱导活性均存在显著性差异,其中E1与sERα结合的EC50为3.69nM,相对雌激素结合活性(relative estrogenic bindinactivity, RBA)为65.7%,与mERα结合的EC50为16.98nM, RBA为33.34%,E1与sERα的结合活性是mERα的4.6倍。OP、BPA、Genistein、Zearalenone与sERα和mERα结合后的诱导活性均也都存在差异性显著,其中Genistein与sERα结合活性为mERα的9.28倍。与四类雌激素活性物质活性的比较说明,sERα比mERα具有更高的结合活性,这可能是导致辽东湾野生梭鱼雌雄同体高发生率的一个可能原因。4.E1相对雌激素活性较高,在环境样品中被广泛检出,且与梭鱼ER的结合的EC50是Madaka的4.6倍,所以E1可能在梭鱼雌雄同体的发生中起重要的作用,值得结合体外实验的数据在体内暴露实验中进一步研究。上述结果表明,所构建的sERα物种特异性双杂交酵母可用于环境中梭鱼雌激素活性物质的筛选和活性评价。和青鳉鱼ERα相比,梭鱼ERα对所测试的几咱雌激素活性物质具有更高的敏感性,这可能是导致野生梭鱼雌雄同体高发的原因之一。