哮喘大鼠气道平滑肌肌浆网钙泵和磷酸受纳蛋白的表达及药物的干预作用

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前言:支气管哮喘(Asthma或Bronchial Asthma)是一种以气流可逆性阻塞、气道慢性炎症、气道高反应性为特征的复杂的炎症性疾病,是严重影响人们健康的常见病、多发病。哮喘发病机制十分复杂,但不管何种机制,所引起的支气管哮喘的发生都是和气道平滑肌(airway smooth muscle,ASM)的结构和功能异常是分不开的。钙是引起平滑肌收缩的关键物质,胞浆游离钙浓度([Ca2+]i)下降会产生平滑肌丝的松弛。在气道平滑肌中,肌浆网Ca2+-ATP酶(SERCA)将胞浆内钙离子摄入肌浆网内,是[Ca2+]i下降的主要途径。气道平滑肌主要表达SERCA2b同工型钙泵。SERCA2b活性大部分则由磷酸受纳蛋白(Phospholambam,PLB)调节。国内外均有研究显示,SERCA和PLB基因及蛋白表达的改变导致心肌细胞收缩功能受损,而应用β受体阻滞剂能增加受损心肌SERCA基因及蛋白的表达,同时减少PLB基因和蛋白的表达,从而部分恢复心肌细胞的正常收缩功能。那么,在哮喘的发病过程中,气道平滑肌SERCA和PLB基因及蛋白表达的改变是否也发挥了一定的作用?哮喘治疗药物长效β2受体激动剂和吸入用糖皮质激素治疗哮喘机制是否有气道平滑肌SERCA和PLB基因及蛋白表达的改变参与其内?这些问题尚需实验进一步探讨。目的:采用主动致敏后重复抗原攻击的大鼠为哮喘模型,观察气道平滑肌SERCA和PLB基因及蛋白表达的改变。并且在动物模型上应用选择性SERCA抑制剂环匹阿尼酸,观察其疗效,以确定其在哮喘发病机制中的作用。应用长效β2受体激动剂和吸入用糖皮质激素,观察疗效,探讨它们治疗哮喘机制是否有SERCA和PLB基因及蛋白表达的改变参与其内。方法:将清洁级健康雄性SD大鼠48只,随机分为六组,每组8只,即福莫特罗组、布地奈德组、福莫特罗+布地奈德组、环匹阿尼酸组、对照组、模型组。通过卵白蛋白致敏及攻击后建立大鼠哮喘模型,并在每次攻击前,相应将各组用药雾化吸入。最后一次雾化24小时后,进行肺功能测定,并计算肺阻力,肺动态顺应性。大鼠放血处死后,进行肺泡灌洗,计数肺泡灌洗液(BALF)中白细胞总数和嗜酸性粒细胞比例,取肺组织进行病理切片以观察肺组织炎症情况。分离气管平滑肌用TRIZOL提取总RNA,RT-PCR法半定量测定支气管平滑肌中SERCA和PLB mRNA的表达水平;用蛋白裂解液提取总蛋白,用Western blot法半定量测定支气管平滑肌中SERCA和PLB蛋白的表达水平。结果:1.大鼠哮喘模型建立:模型组大鼠经抗原攻击后测肺功能,肺阻力较对照组明显升高(P<0.01),肺动态顺应性则显著下降(P<0.01);气道内出现了以嗜酸性粒细胞(Eos)浸润为主的炎症反应,表现为BALF中Eos计数较对照组明显升高(P<0.01);病理切片也发现平滑肌增生肥厚,间质嗜酸性粒细胞等炎症细胞浸润明显增多。以上均为大鼠哮喘模型的基本特征,提示哮喘模型建立成功。2.药物治疗影响:①哮喘大鼠经福莫特罗、布地奈德治疗后,与模型组相比,肺动态顺应性均明显上升(P<0.01),肺阻力也都有显著下降(P<0.01),两药联用组虽然也有明显的肺功能改善(P<0.01),但较单一用药效果差异不显著。环匹阿尼酸治疗组肺功能则无明显缓解。BALF计数结果显示布地奈德组(P<0.05)和联合治疗组(P<0.01)的BALF细胞总数明显较模型组减少;嗜酸性粒细胞总数福莫特罗组(P<0.01)、布地奈德组(P<0.01)、福莫特罗+布地奈德组(P<0.01)、环匹阿尼酸组(P<0.05)均比模型组有明显下降。以上结果提示福莫特罗,布地奈德治疗有效。②SERCA和PLB基因和蛋白的表达水平:模型组的SERCA基因和蛋白表达水平较对照组均有明显上调(P<0.01);和模型组相比,布地奈德组、联合治疗组和环匹阿尼酸组的SERCA mRNA水平有明显的下降(P<0.05),SERCA蛋白水平也有下降,但统计无明显差异;而福莫特罗组则无明显改变。模型组的PLB基因和蛋白表达水平也较对照组有明显上升(P<0.01);布地奈德组和联合治疗组的PLB基因和蛋白表达水平较模型组有显著下调(P<0.05);而福莫特罗和环匹阿尼酸组的PLB基因和蛋白表达水平虽然有下降,但没有统计学差异。结论:1.大鼠哮喘模型中SERCA、PLB基因和蛋白表达明显增加,提示SERCA和PLB基因和蛋白表达改变参与了哮喘发病机制。2.长效β2受体激动剂福莫特罗对大鼠气道平滑肌SERCA、PLB基因和蛋白表达无明显作用。3.吸入型糖皮质激素布地奈德对大鼠气道平滑肌SERCA、PLB基因表达有明显的抑制作用。提示了糖皮质激素治疗哮喘机制可能有SERCA、PLB基因表达改变参与。
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