论文部分内容阅读
前言：支气管哮喘（Asthma或Bronchial Asthma）是一种以气流可逆性阻塞、气道慢性炎症、气道高反应性为特征的复杂的炎症性疾病，是严重影响人们健康的常见病、多发病。哮喘发病机制十分复杂，但不管何种机制，所引起的支气管哮喘的发生都是和气道平滑肌（airway smooth muscle，ASM）的结构和功能异常是分不开的。钙是引起平滑肌收缩的关键物质，胞浆游离钙浓度([Ca2+]i)下降会产生平滑肌丝的松弛。在气道平滑肌中，肌浆网Ca2+-ATP酶（SERCA）将胞浆内钙离子摄入肌浆网内，是[Ca2+]i下降的主要途径。气道平滑肌主要表达SERCA2b同工型钙泵。SERCA2b活性大部分则由磷酸受纳蛋白（Phospholambam，PLB）调节。国内外均有研究显示，SERCA和PLB基因及蛋白表达的改变导致心肌细胞收缩功能受损，而应用β受体阻滞剂能增加受损心肌SERCA基因及蛋白的表达，同时减少PLB基因和蛋白的表达，从而部分恢复心肌细胞的正常收缩功能。那么，在哮喘的发病过程中，气道平滑肌SERCA和PLB基因及蛋白表达的改变是否也发挥了一定的作用?哮喘治疗药物长效β2受体激动剂和吸入用糖皮质激素治疗哮喘机制是否有气道平滑肌SERCA和PLB基因及蛋白表达的改变参与其内?这些问题尚需实验进一步探讨。目的：采用主动致敏后重复抗原攻击的大鼠为哮喘模型，观察气道平滑肌SERCA和PLB基因及蛋白表达的改变。并且在动物模型上应用选择性SERCA抑制剂环匹阿尼酸，观察其疗效，以确定其在哮喘发病机制中的作用。应用长效β2受体激动剂和吸入用糖皮质激素，观察疗效，探讨它们治疗哮喘机制是否有SERCA和PLB基因及蛋白表达的改变参与其内。方法：将清洁级健康雄性SD大鼠48只，随机分为六组，每组8只，即福莫特罗组、布地奈德组、福莫特罗+布地奈德组、环匹阿尼酸组、对照组、模型组。通过卵白蛋白致敏及攻击后建立大鼠哮喘模型，并在每次攻击前，相应将各组用药雾化吸入。最后一次雾化24小时后，进行肺功能测定，并计算肺阻力，肺动态顺应性。大鼠放血处死后，进行肺泡灌洗，计数肺泡灌洗液（BALF）中白细胞总数和嗜酸性粒细胞比例，取肺组织进行病理切片以观察肺组织炎症情况。分离气管平滑肌用TRIZOL提取总RNA，RT-PCR法半定量测定支气管平滑肌中SERCA和PLB mRNA的表达水平；用蛋白裂解液提取总蛋白，用Western blot法半定量测定支气管平滑肌中SERCA和PLB蛋白的表达水平。结果：1．大鼠哮喘模型建立：模型组大鼠经抗原攻击后测肺功能，肺阻力较对照组明显升高（P＜0.01），肺动态顺应性则显著下降（P＜0.01）；气道内出现了以嗜酸性粒细胞（Eos）浸润为主的炎症反应，表现为BALF中Eos计数较对照组明显升高（P＜0.01）；病理切片也发现平滑肌增生肥厚，间质嗜酸性粒细胞等炎症细胞浸润明显增多。以上均为大鼠哮喘模型的基本特征，提示哮喘模型建立成功。2．药物治疗影响：①哮喘大鼠经福莫特罗、布地奈德治疗后，与模型组相比，肺动态顺应性均明显上升（P＜0.01），肺阻力也都有显著下降（P＜0.01），两药联用组虽然也有明显的肺功能改善（P＜0.01），但较单一用药效果差异不显著。环匹阿尼酸治疗组肺功能则无明显缓解。BALF计数结果显示布地奈德组（P＜0.05）和联合治疗组（P＜0.01）的BALF细胞总数明显较模型组减少；嗜酸性粒细胞总数福莫特罗组（P＜0.01）、布地奈德组（P＜0.01）、福莫特罗+布地奈德组（P＜0.01）、环匹阿尼酸组（P＜0.05）均比模型组有明显下降。以上结果提示福莫特罗，布地奈德治疗有效。②SERCA和PLB基因和蛋白的表达水平：模型组的SERCA基因和蛋白表达水平较对照组均有明显上调（P＜0.01）；和模型组相比，布地奈德组、联合治疗组和环匹阿尼酸组的SERCA mRNA水平有明显的下降（P＜0.05），SERCA蛋白水平也有下降，但统计无明显差异；而福莫特罗组则无明显改变。模型组的PLB基因和蛋白表达水平也较对照组有明显上升（P＜0.01）；布地奈德组和联合治疗组的PLB基因和蛋白表达水平较模型组有显著下调（P＜0.05）；而福莫特罗和环匹阿尼酸组的PLB基因和蛋白表达水平虽然有下降，但没有统计学差异。结论：1．大鼠哮喘模型中SERCA、PLB基因和蛋白表达明显增加，提示SERCA和PLB基因和蛋白表达改变参与了哮喘发病机制。2．长效β2受体激动剂福莫特罗对大鼠气道平滑肌SERCA、PLB基因和蛋白表达无明显作用。3．吸入型糖皮质激素布地奈德对大鼠气道平滑肌SERCA、PLB基因表达有明显的抑制作用。提示了糖皮质激素治疗哮喘机制可能有SERCA、PLB基因表达改变参与。