骨关节炎(Osteoarthritis,OA)又称退行性关节炎,是一种以软骨退行性改变为主要特征的慢性关节疾病,是导致老年人活动障碍的主要原因。大量研究表明,关节局部及全身性炎症反应在OA发病中起着核心作用,调控及抑制其主要效应通路NF-κB信号通路的过度持续激活对于维持软骨基质代谢平衡、延缓OA进展具有重要意义。既往的研究发现,核受体 NR4A1(Nuclear receptor subfamily 4,group A-1,NR4A1)对炎症反应尤其NF-κB信号通路具有重要的调控作用,不仅可以通过直接与p65结合的方式减弱p65与DNA结合的能力,抑制其下游基因的表达,还可以直接促进其他NF-1κB抑制因子如IκB的表达,通过非蛋白-蛋白相互作用的方式间接调控NF-κB的活性。在其他炎症相关性疾病如血管粥样硬化的研究中,激活NR4A1被证实可以显著抑制炎症反应、延缓疾病进展,但是在骨关节炎中,NR4A1对炎症反应及NF-κB信号通路的抑制作用尚未有深入研究。因此,本研究旨在探究NR4A1对软骨炎症反应的调控作用,完善骨关节炎发病机制,希望为OA的治疗提供新的治疗靶点。在本研究中,检测了人OA软骨组织中NR4A1的表达改变,在体外明确了 NR4A1对软骨细胞炎症反应及NF-κB信号的调控作用,探索了长期炎症反应对NR4A1表达及活性的影响,并在体内及体外实验中验证了 NR4A1特异性激动剂cytosporoneB对软骨退变的保护作用。最后,还在体内及体外初步探索了 NR4A1对炎症微环境下软骨祖细胞(Cartilage Progenitor Cells,CPCs)增殖分化能力的影响。本研究共分为以下3个部分:1)NR4A1在骨关节炎组织及体外OA模型中的表达情况;2)NR4A1与NF-κB信号通路的相互作用及对软骨细胞及骨关节炎的影响;3)NR4A1对炎症微环境下软骨祖细胞的作用及机制研究。第一章 NR4A1在骨关节炎组织及体外OA模型中的表达情况目的:探究NR4A1在人骨关节炎组织及大鼠体外OA模型中的表达情况及机制。方法:收集了在浙江大学医学院附属第二医院行髋置换手术的髋关节OA患者及股骨颈骨折患者手术中废弃的关节软骨各10例。通过RT-PCR、Western-blot、免疫荧光等方法对人OA软骨及正常软骨中NR4A1、软骨炎症及基质降解相关基因、NF-κB信号通路核心效应分子p65的表达及组织内定位情况进行了检测。通过应用IL-1β处理体外分离培养的大鼠软骨细胞,进行体外OA造模,检测了其中NR4A1的表达情况。在体外OA模型中,分析检测不同浓度NF-κB信号通路抑制剂JSH23对NR4A1高表达的影响。结果:OA软骨组织中炎症及基质降解相关基因MMP3、MMP9、MMP13、COX-2、iNOS的mRNA水平较正常软骨组织显著增高(P<0.05)。在OA软骨组织中,NR4A1及p65在蛋白质水平及mRNA水平均显著高表达(P<0.05),而且二者的表达强度具有一定协同性。免疫荧光显示OA磨损区软骨组织中NR4A1及p65均显著高表达,且二者具有共同的细胞定位。体外OA模型中,IL-1β处理后的大鼠软骨细胞中NR4A1显著高表达,而NF-κB信号通路抑制剂JSH23可以呈浓度依赖的方式显著抑制NR4A1高表达(P<0.05)。结论:NR4A1在OA软骨组织及体外OA模型中显著高表达;其表达增高是通过NF-κB信号通路的激活实现的。第二章 NR4A1与NF-κB信号通路的相互调控及对骨关节炎的影响目的:明确NR4A1对软骨细胞炎症反应的作用及机制,探索长期炎症反应对软骨细胞中NR4A1的表达及活性的影响及机制,在体内及体外实验中验证了 NR4A1特异性激动剂cytosporone B对软骨退变的保护作用。方法:在大鼠软骨细胞中,通过过表达质粒及siRNA的方法,过表达或敲低NR4A1的表达。通过RT-PCR、Western-blot、免疫荧光、荧光素酶报告激活基因活性检测等方法检测过表达或敲低NR4A1后软骨细胞对IL-1β诱导的软骨炎症及基质降解相关基因表达情况以及NF-κB信号通路的激活情况。通过RT-PCR、Western-blot检测IL-1β长期作用于大鼠软骨细胞后不同时间点NR4A1表达情况的动态变化,检测组蛋白H3第27位赖氨酸(H31ys27)、H4第8位赖氨酸(H41ys8)的乙酰化水平和组蛋白去乙酰化酶(Histonedeacetylase,HDAC)1 2、3、4、5、6、7、9、10的表达改变,以及应用HDACs抑制剂SAHA后大鼠软骨细胞内长期IL-1β刺激下NR4A1的表达情况。通过Western-blot检测IL-1 β作用下大鼠软骨细胞中NR4A1磷酸化水平,以及分别应用p38抑制剂SB203580、JNK抑制剂SP600125、ERK抑制剂FR180204后的改变。通过RT-PCR、Western-blot检测检测不同浓度cytosporoneB处理下的软骨细胞对IL-1β诱导的软骨炎症及基质降解相关基因表达情况及NR4A1的表达和磷酸化水平。通过内侧半月板切除术对大鼠进行膝关节OA造模,术后每周关节腔分别注射1μM cytosporoneB或等量溶剂,造模后6周、12周分别取材进行蕃红O染色。结果:过表达NR4A1在mRNA及蛋白水平显著抑制IL-1β诱导的软骨炎症及基质降解相关基因COX-2、iNOS及MMP3、9、13高表达(P<0.05),而在NR4A1敲低组中这些基因表达均显著增加(P<0.05)。免疫荧光显示,IL-1β诱导的p65入核在NR4A1过表达组中显著减少,而在NR4A1敲低组中增加。过表达NR4A1显著抑制IL-1β诱导的NF-κB信号通路荧光素酶报告基因活性(P<0.05),而敲低NR4A1使IL-1β诱导的NF-κB信号通路荧光素酶报告基因活性增加(P<0.05)。IL-1β处理使大鼠软骨细胞NR4A1表达快速增加,但是长期处理其表达量相对抑制。组蛋白H3 lys27、H4lys8的乙酰化水平在IL-1β长期作用下减少,且HDAC1-6、HDAC10在IL-1β处理后不同时间点均有显著高表达;HDAC抑制剂SAHA处理可以促进大鼠软骨细胞在IL-1β作用72小时后NR4A1表达。IL-1β处理会引起大鼠软骨细胞内NR4A1磷酸化水平显著增加,增加的NR4A1磷酸化可以被p38抑制剂SB203580、JNK 抑制剂 SP600125、ERK 抑制剂 FR180204 不同程度抑制。cytosporone B可以呈浓度依赖的显著抑制IL-1β诱导的大鼠软骨细胞COX2、iNOS、MMP3、MMP9、MMP13基因在mRNA及蛋白水平的高表达。cytosporoneB可以呈浓度依赖的促进NR4A1基因的表达,并显著降低IL-1β导致的NR4A1磷酸化。在大鼠内侧半月板切除OA模型中,蕃红O染色显示关节腔注射cytosporoneB软骨结构更加完整,蕃红染色丢失更少。结论:NR4A1可以通过抑制NF-κB信号通路有效抑制软骨细胞炎症反应及软骨退变;持续炎症刺激一方面通过HDAC依赖的组蛋白修饰抑制NR4A1的转录水平,另一方面通过激活MAPK通路磷酸化NR4A1、抑制其活性;Cytosporone B可以重新激活NR4A1活性并在体内及体外抑制软骨细胞炎症慢性化,减缓OA进程。第三章NR4A1对炎症微环境下软骨祖细胞的作用及机制研究目的:探索NR4A1对炎症微环境下软骨祖细胞增殖分化能力的影响及机制。方法:通过极低密度种植的方法,分离培养出大鼠软骨细胞中具有单克隆形成能力的软骨祖细胞,并进行成软骨、成骨、成脂肪分化能力验证,通过流式细胞术检测其细胞表面CD29、CD34、CD45、CD90的表达。通过CCK-8试验检测NR4A1特异性激动剂cytosporoneB对IL-1β作用下的软骨祖细胞的增殖能力,绘制增殖曲线,并通过Western-blot检测cleaved caspase3表达量。通过划痕试验检测cytosporone B对IL-1β作用下的软骨祖细胞迁移能力的影响。通过RT-PCR、Western-blot、蕃红O染色检测cytosporone B对IL-1β作用下的软骨祖细胞在平面成软骨诱导10天后软骨染色差异,软骨相关基因二型胶原、Aggrecan、SOX9的表达情况,以及smad3、磷酸化smad3、β-catenin、激活状态β-catenin的表达情况。对新生C57小鼠腹腔注射BdrU(50mg/kg),连续3天,其后自然成长至成年(8周),取材膝关节,通过免疫荧光检测软骨组织BrdU及Ki67表达情况。对腹腔注射过的小鼠进行前交叉韧带切术行OA造模,术后即可开始腹腔注射cytosporone B(10mg/kg)或等量溶剂,每两天一次,造模后7天取材膝关节,通过免疫荧光检测软骨组织BrdU及Ki67表达情况。结果:分离培养的大鼠软骨祖细胞均成软骨、成骨、成脂分化能力,流式细胞术检测发现其CD34、CD45阴性,CD29、CD90阳性。CCK-8实验显示,软骨祖细胞在IL-1β作用下增殖能力下降,处理72小时时间点其相对OD值显著低于对照组(P<0.05),而NR4A1激动剂cytosporone B可以呈浓度依赖的方式逆转IL-1β引起的软骨祖细胞增殖能力下降(P<0.05);Western-blot显示cytosporoneB可以呈浓度依赖的方式显著抑制IL-1β引起的大鼠软骨祖细胞cleavedcaspase3的表达。划痕实验显示IL-1β处理下软骨祖细胞的迁移距离显著低于对照组(P<0.05),而cytosporoneB组的迁移距离显著大于IL-1β处理组(P<0.05)。平面软骨诱导10天后,IL-1β处理组二型胶原、Aggrecan、SOX9的mRNA水平显著低于对照组(P<0.05)蕃红O染色更浅,而cytosporoneB组对应基因的表达情况随着浓度增加而增加,且在1μM时这些基因表达均显著高于IL-1β组(P<0.05),蕃红O染色接近对照组;Western-blot结果显示IL-1β处理可以抑磷酸化smad3、激活状态β-catenin的水平,而cytosporone B可以逆转这些抑制性改变。BrdU标记实验结果显示,正常成年小鼠中膝关节软骨表面具有一群BrdU阳性Ki67阴性的细胞,OA造模后7天,部分BrdU阳性的细胞出现Ki67阳性,且cytosporoneB处理组中BrdU、Ki67双阳性细胞比例显著高于对照组(P<0.05)。结论:NR4A1激动剂cytosporoneB可以改善炎症微环境下软骨祖细胞的增殖、迁移能力及软骨分化能力。