试验目的:探究microRNA-708(miR-708)靶向调控LEF1基因介导Wnt信号通路对小鼠黑色素瘤细胞的增殖、EMT和凋亡的调控机制。试验方法:(1)细胞株筛选 试验选用4种黑色素瘤细胞株B16、A375、WM239和WM451,培养后,提取细胞的总RNA后,用逆转录试剂盒进行逆转录制备cDNA,并设计 miR-708、U6 的 PCR 引物,运用 qRT-PCR(Quantitative real time polymerse chain reacton,定量即时聚合酶连锁反应)方法,以U6为参照,检测miR-708在各组细胞中的表达情况,选择相对表达最高的B16黑色素瘤细胞株用于后续细胞实验。(2)小鼠黑色素瘤模型及各指标表达情况 最佳黑色素瘤细胞株确定后,选择清洁级雄性昆明种小鼠40只用于试验。试验动物分为正常组和模型组:模型组小鼠用眼科剪小心剪去左后肢内侧鼠毛,消毒后,抽取预先制备的黑色素瘤细胞单细胞悬液0.2 mL,接种于小鼠左后肢内侧皮下,待接种的瘤细胞成瘤直径达到约0.6 cm时,处死动物,剥离肿瘤块;正常组不接种黑色素瘤细胞,其它操作方法和过程相同。①所取组织用HE染色法染色,进行病理观察。同时,用免疫组化方法检测LEF1蛋白表达阳性率,在高倍显微镜下进行阳性细胞数的计数,计算平均阳性表达率。②运用前述qRT-PCR检测方法,分别设计miR-708、U6、LEF1、β-catenin、Wnt3a、bcl-2、N-cadherin、Bax、Caspase3、E-cadherin 和 GAPDH 的 PCR 引物,以U6为miR-708的相对表达水平检测的内参,以GAPDH为LEF1、β-catenin、Wnt3a、bcl-2、N-cadherin、Bax、Caspase3、E-cadherin 相对表达水平的内参,检测了两组组织中相关mRNA的表达水平,并进行比较分析。③正常组和模型组中 LEF1、β-catenin、Bcl-2、Bax、Caspase3、Wnt3a、E-cadherin、N-cadherin相关蛋白表达水平的检测则采用Western blot方法。试剂盒提取总蛋白后,进行电泳、转膜,并使蛋白质与各自的特异性抗体结合,最后使用HRP标记的二抗检测确定最终含量。(3)靶向关系验证及细胞试验 在细胞及分子试验水平上,生物信息学网站和双荧光素酶报告方法对miR-708与LEF1的靶向关系进行确认,并将细胞进行分组试验:Control组为正常细胞组;Blank组则不转染任何序列;NC组为阴性对照,转染miR-708阴性对照序列;miR-708 mimics组转染了可增强miR-708表达的 miR-708 mimics;miR-708 inhibitors组 转染了 可抑制 miR-708 表达的miR-708 inhibitors;siRNA-LEF1 组转染 了干扰 LEF 的表达的 siRNA-LEF1;miR-708 inhibitors + siRNA-LEF1组转染了仅能抑制miR-708表达又能干扰LEF表达的 miR-708 inhibitors 和 siRNA-LEF1。①靶向关系确定:通过生物学预测网microRNA.org进行了 miR-708的靶基因分析,并验证LEF1是否为miR-708的直接靶基因。②同样地,细胞转染后,使用qRT-PCR检测方法对7组细胞中的miR-708、LEF1、β-catenin、Wnt3a、bcl-2、N-cadherin、bax、E-cadherin 及 Caspase3 等相关基因的mRNA的表达水平进行了测定,并进行分析比较。③再使用Western blot检测方法对7组细胞中的miR-708、LEF1、β-catenin、Wnt3a、bcl-2、N-cadherin、bax、E-cadherin 及 Caspase3 等蛋白表达水平进行了测定,并进行分析比较。④MTT试验:细胞转染培养48h后,以每孔3×103～6×103个细胞接种于96孔板中培养,然后用酶联免疫检测仪检测各组细胞570 nm处吸光度值(OD值),以OD值为纵坐标绘制细胞活力曲线图,测定了转染后各组细胞的增殖能力。⑤划痕试验:细胞转染48h后,分别接种各组细胞到6孔板,培养至细胞融合度达90%～100%时,进行划痕试验,检测各组细胞迁移情况。⑥Transwell实验检测各组细胞侵袭情况。⑦细胞周期与凋亡情况检测:细胞周期观察和细胞凋亡情况的测定使用流式细胞仪进行,细胞周期在488 nm处荧光下检测,凋亡细胞检测则以488 nm波长为激发光,525 nm、620 nm下检测。试验结果:(1)细胞株筛选 通过选用4种黑色素瘤细胞株B16、A375、WM239和WM451进行试验并进行测定后,结果显示miR-708在4种黑色素瘤细胞株中均有不同程度的表达,比较结果中,miR-708在B16中的表达量最高,且明显高于其它3中黑色素瘤细胞株中的表达水平(P<0.05)。因而后续细胞试验选择高miR-708表达的B16黑色素瘤细胞株进行操作。(2)小鼠黑色素瘤模型①建立小鼠黑色素瘤模型后,分别进行正常组和模型组的组织HE染色及病理学观察,结果显示:与正常组相比,模型组细胞大小不一,体积较大,形状不规则,仅少部分细胞的胞质内可见黑色素颗粒。组织内可见较大片坏死,黑色素瘤间质及周围组织内见少量炎症细胞浸润。同时,LEF1蛋白在正常组中的表达阳性率为(20.31 ±5.28)%,明显低于模型组中的(65.35 ±6.85)%,差异具有统计学意义(P<0.05)。结果说明受到肿瘤的影响,B16黑色素瘤细胞模型组小鼠LEF1蛋白表达量增加,明显高于正常组的LEF1蛋白表达水平。结果也说明LEF1参与了黑色素瘤细胞的恶性转化过程。②根据qRT-PCR检测结果,与正常组相比,模型组miR-708、Bax、Caspase3、E-cadherin 相关基因 mRNA 表达水平显著降低,而 LEF1、β-catenin、Bcl-2、Wnt3a、N-cadherin相关基因mRNA表达水平显著升高。差异具有统计学意义(P ＜ 0.05)。③根据Western blot检测结果,与正常组相比,模型组Bax、Caspase3、E-cadherin 表达水平显著降低,LEF1、β-catenin、Bcl-2、Wnt3a、N-cadherin 表达水平显著升高。差异具有统计学意义(P<0.05)。结果也证明了 miR-708以及Bax、Caspase3、E-cadherin、LEFl、β-catenin、Bcl-2、Wnt3a、N-cadherin 等相关基因和蛋白与黑色素瘤细胞的形成和发展密切相关。(3)靶向关系验证及细胞试验①靶向关系确定:通过生物学预测网microRNA.org进行了 miR-708的靶基因在线分析结果,LEF1基因序列与miR-708序列间存在特异结合区域,LEF1是miR-708的靶基因。同时,根据荧光素酶报告法检测结果及比较结果可看出:与NC组比较,miR-708 mimics转染组中野生型Wt-miR-708/LEF1共转染组的荧光素酶信号下降(P<0.05);而突变型3’UTR的荧光素酶活性无明显差异(P>0.05),说明miR-708能特异结合LEF1基因。②对细胞转染后各组的相关mRNA的表达水平进行测定分析,结果显示:与 Control 组相比,其余各组 miR-708、Bax、Caspase3、E-cadherin 的 mRNA 表达显著降低(均P＜0.05),LEF1、β-catenin、Bcl-2、Wnt3a、N-cadherin 的 mRNA表达显著升高(均P＜0.05)。与Blank和NC组比较,miR-708 mimics组和siRNA-LEF 1 组 Bax、Caspase3、E-cadherin 的 mRNA 表达量显著增加(均 P<0.05),LEF1、β-catenin、Bcl-2、Wnt3a、N-cadherin 的 mRNA 表达量显著降低(均 P<0.05)。与Blank和NC组比较,miR-708 mimics组miR-708表达显著增加(均P<0.05),siRNA-LEFl 组 miR-708 表达无明显差异(P>0.05)。与 Blank 和 NC组比较,转染 miR-708 inhibitors 组 miR-708、Bax、Caspase3、E-cadherin 的 mRNA表达量显著降低(均 P＜ 0.05),LEF1、β-catenin、Bcl-2、Wnt3a、N-cadherin的mRNA表达量显著增加(均P<0.05)。与Blank和NC组比较,miR-708 inhibitors + siRNA-LEF1 组细胞中 miR-708 表达量显著降低(P<0.05),而 Bax、Caspase3、E-cadherin、LEF1、β-catenin、Bcl-2、Wnt3a、N-cadherin 的 mRNA表达量差异无统计学意义(均P>0.05)。③ 相应的,细胞转染后相关蛋白表达结果为:与Control组相比,其余组Bax、Caspase3、E-cadherin 的蛋白表达显著降低(均P＜0.05),LEF1、β-catenin、Bcl-2、Wnt3a、N-cadherin的蛋白表达显著升高(均P<0.05)。Blank和NC组相比无明显差异(P>0.05)。与 Blank 和 NC 组比较,miR-708 mimics 组和 siRNA-LEF1组Bax、Caspase3、E-cadherin的蛋白表达量显著增加(均P＜0.05),LEF1、β-catenin、Bcl-2、Wnt3a、N-cadherin的蛋白表达量显著降低(均P<0.05)。与Blank 和 NC 组比较,转染 miR-708 inhibitors 组 Bax、Caspase3、E-cadherin 的蛋白表达量显著降低(均 P＜0.05),LEF1、β-catenin、Bcl-2、Wnt3a、N-cadherin的蛋白表达量显著增加(均P＜ 0.05)。与Blank和NC组比较,miR-708 inhibitors+ siRNA-LEF1 组细胞中 Bax、Casβase3、E-cadherin、LEF1、β-catenin、Bcl-2、Wnt3a、N-cadherin的蛋白表达量差异无统计学意义(均P>0.05)。④MTT试验结果:与Control组相比,其余各组细胞转染48h及72h的OD值均明显升高(均P<0.05),细胞增殖能力增强。与Blank组和NC组相比,miR-708 inhibitors组细胞转染48h及72h的OD值明显升高(均P<0.05);而miR-708 mimics 组、siRNA-LEF 1 组细胞转染 48h 及 72h 的 OD 值降低(均P<0.05);miR-708 inhibitors +siRNA-LEFl 组则无明显变化(P ＞0.05)。⑤划痕试验结果:Blank组与NC组迁移能力比较无明显差异(P>0.05)。与Blank组和NC组相比,miR-708 mimics组和siRNA-LEF1组细胞迁移能力都显著减弱(均P<0.05),miR-708 inhibitors组迁移能力显著增强(P ＜ 0.05),miR-708 inhibitors + siRNA-LEF1 组细胞迁移能力变化不明显(P>0.05)。⑥Transwell实验检测各组细胞侵袭情况及结果:Blank组与NC组侵袭能力比较无明显差异(P＞0.05)。与Blank组与NC组相比,miR-708 mimics组以及siRNA-LEF1组细胞侵袭能力显著降低(P<0.05),miR-708 inhibitors组侵袭能力显著增强(P<0.05),miR-708 inhibitors + siRNA-LEF1组细胞迁移能力差异不显著(P>0.05)。⑦细胞周期情况:与Control组相比,Blank组、NC组、miR-708 mimics组、siRNA-LEF1 组、miR-708 inhibitors 组、miR-708 inhibitors + siRNA-LEF1 组周期改变主要表现在G0/G1期缩短和S期延长(均P ＜ 0.05)。与Blank组和NC组相比,miR-708 mimics组、siRNA-LEF1组表现在G0/G1期延长和S期缩短;miR-708 inhibitors 组表现在 G0/G1 期缩短和 S 期延长(P<0.05);miR-708 inhibitors + siRNA-LEF1 组无明显差异(P ＞ 0.05)。⑧细胞凋亡情况:与Control相比,Blank组、NC组、miR-708 mimics组、miR-708 inhibitors 组、siRNA-LEF1 组、miR-708inhibitors +siRNA-LEF1 组细胞凋亡率依次呈显著下降趋势,差异具有显著的统计学意义(P＜ 0.05)。与Blank组与NC组相比,miR-708 inhibitors组细胞凋亡呈下降趋势,miR-708 mimics、siRNA-LEF 1 组细胞凋亡呈上升趋势(P<0.05),miR-708 inhibitors +siRNA-LEF1组细胞凋亡率的差异无统计学意义(P>0.05)。试验结论:miR-708、LEF1、Bax、Caspase3、E-cadherin、β-catenin、Bcl-2、Wnt3a、N-cadherin等相关基因和蛋白参与了黑色素瘤细胞的增殖、侵袭、迁移、细胞周期及凋亡调控过程,对黑色素瘤细胞的发生、发展过程中造成重要影响。miR-708、Bax、Caspase3、E-cadherin相关mRNA和蛋白质表达水平与黑色素瘤发展有负向关系,LEF1、β-catenin、Bcl-2、Wnt3a、N-cadherin 相关 mRNA 和蛋白质表达水平与黑色素瘤发展有正向关系。同时,在LEF1基因序列上具有miR-708特异结合的片段,LEF1基因是miR-708的特异性靶点。miR-708可抑制黑色素瘤细胞的增殖、EMT,并促进细胞凋亡,其机制与其靶向调控LEF1基因表达,介导Wnt信号通路相关作用有关。