A型血友病是一种由factor Ⅷ基因缺陷导致的凝血因子Ⅷ缺乏的出血性遗传疾病。目前输注凝血因子等替代疗法是该疾病的主要治疗方式,但该方法存在半衰期短、成本高、疗效随使用周期的增加而减弱等缺陷。因此,亟待探寻新的更有效的治疗方法。在过去几十年里基因治疗迅速发展,它是一种以分子生物学技术为基础,来靶向治疗遗传性疾病的新型手段。血友病主要是由于单一蛋白质的功能失调而引起的,这一特点使它成为治疗该疾病的最佳选项之一,并为血友病提供一次性治愈的可能。然而,基因治疗载体的选择、factor Ⅷ基因的大小、factor Ⅷ蛋白的产生与分泌效率以及基因治疗的免疫原性给A型血友病基因治疗的效果和发展带来了挑战。基于上述问题,我们改造和优化factor Ⅷ基因,由慢病毒作为载体,将该基因导入靶细胞,探究其在体外细胞和体内小鼠模型上的治疗效果,评估该方法在非人灵长类动物模型上的安全性。1.为了解决基因携带的问题,提高基因治疗的效果,我们同其他研究者们合成了一个删除B结构域的factor Ⅷ基因（F8-BDD）,并将其克隆到慢病毒载体中,由此使用慢病毒载体即可解决腺相关病毒载体容量有限的问题。为了提高F8活性产物的分泌水平,我们设计了新的F8-BDD基因版本,即恢复了B结构域中所有的N-糖基化位点（F8-299）。虽然F8-299结构的整体蛋白表达量减少,但在细胞的上清液中检测到极高的凝血活性。同时发现F8-299结构表达的蛋白中factor Ⅷ和血管性血友病因子的相互作用增强。A型血友病小鼠基因治疗的体内实验研究表明,进行携带F8-299基因造血干细胞移植后,在血浆中小鼠factor Ⅷ的活性可达8%,可保持稳定到治疗后第8周,并且小鼠出血表型得到纠正,同时小鼠体内factor Ⅷ蛋白的免疫反应很低。因此,糖基化位点的添加可以提高Factor Ⅷ蛋白活性产物的分泌水平。2.由于原位凝血活性对功能性factor Ⅷ生物表达至关重要,为了降低基因治疗蛋白异位表达带来的免疫反应,我们比较了各类组织特异性的启动子,以期实现目的蛋白的靶向表达。我们利用慢病毒载体携带了一个通用型（EF1α）或组织特异性启动子,包括两个内皮细胞特异性（VEC和KDR）和两个巨核细胞特异性（Gp和ITGA）启动子。在人内皮细胞和巨核细胞系中的基因和蛋白表达水平测试中,发现VEC在体外测试中体现了较高的特异性表达。同时我们还探索了静脉注射对慢病毒载体携带不同启动子在A型血友病小鼠体内实验中的可行性及其表型修正和抗体反应。结果发现,随着时间的推移,经过VEC启动子携带F8-BDD的慢病毒载体治疗后,A型血友病小鼠的血浆factor Ⅷ活性在治疗后60天可达到25%,在治疗后180天甚至可达到80%的高活性,同时VEC启动子的基因治疗在A型血友病小鼠中显示出较低的抗F8免疫应答。因此,内皮细胞特异性启动子的运用可以实现让factor Ⅷ蛋白在靶细胞表达。3.为了同时使分泌效率提高和免疫原性降低,我们采用F8-299结合VEC启动子（VEC-299）,进行了A型血友病小鼠和非人灵长类动物模型基因治疗效果的研究和安全性评估。结果发现到治疗后第60天,VEC-299治疗组的小鼠factor Ⅷ活性增加至约50%左右,于120天逐步上升至200%,且经过剪尾试验的小鼠全部存活。在食蟹猴的安全性实验中,经过慢病毒载体静脉注射治疗的猴子检测到了超生理水平的人factor Ⅷ表达（1.5 IU/m L）,并且各项血生化指标均正常,提示了该治疗的安全性较高。综上所述,经修改的F8-299基因可被有效地包装到慢病毒载体中,在体外产生了高度稳定和功能良好的factor Ⅷ蛋白,并且该蛋白可纠正A型血友病小鼠的出血表型。F8-299结合VEC启动子后,仍具有较高的慢病毒载体包装和传递效率,同时在内皮细胞中具有较高的组织特异性,在A型血友病小鼠中具有较低的免疫原性。另外在非人灵长类动物模型中,我们还证实了该治疗手段较为安全,因此以上研究结果将有助于A型血友病基因治疗在临床转化医学中的发展。