研究背景脑卒中是世界上第二大致死原因和主要的致残原因,给患者家庭及社会带来沉重的负担,对患者和家庭的生活质量都造成很大影响。当前脑血管疾病研究领域的重点之一就是寻找在脑梗死急性期可以促进早期功能恢复的安全有效的新方法。前期基础研究中提示臭氧治疗对组织细胞缺血后具有一定的改善作用。首先臭氧可以直接为缺血组织提供充分能量,可以通过重建细胞的氧化还原平衡,减少生物大分子的损伤。其次,研究认为臭氧可以提高组织活性、改善缺氧组织的供氧、恢复细胞功能,从而有效的改变缺氧组织的氧代谢。臭氧自体血回输(major ozonated autoheamotherapy,MOAH)可维持脑组织在缺血缺氧状态下的ATP和能量代谢,减少细胞凋亡。再次,臭氧可以恢复抗氧化系统能力,而这是治疗典型慢性炎症性疾病损伤、纠正氧化应激的关键,有研究发现在脑梗死后,特别是脑缺血再灌注后引起的脑水肿及组织破坏可能是由氧自由基产生的大量产物引起的,臭氧可以激活抗氧化酶和清除自由基,从而减轻急性脑梗死后坏死期神经细胞损伤。在临床应用方面,许多研究认为臭氧自体血回输可以减轻慢性氧化应激,延缓严重并发症,提高糖尿病患者的生活质量、改善脑血流,这些研究结果支持臭氧治疗应用于缺血性及代谢性疾病；也有研究认为臭氧进入人体后迅速与血红蛋白结合,使O2变成O3,提高了血氧饱和度,激活红细胞代谢,使脑组织的供氧状况得到改善,进而改善脑部血液循环,提高脑组织细胞活性,即改善缺血半暗带区的缺氧状态,促进侧支循环的生成,使神经细胞功能恢复。目前臭氧自体血回输对缺血性疾病具有较好的治疗及改善作用,如果能够明确臭氧自体血回输对急性脑缺血后的临床功能的作用,并进一步明确其对缺血神经细胞凋亡、氧自由基损伤的影响,将会为臭氧自体血回输在脑梗死急性期治疗提供可靠的循证医学证据,并可进一步促进其的临床推广应用。研究内容：我们拟建立SD大鼠大脑中动脉闭塞(Middle cerebral artery occlusion, MCAO)脑缺血模型,通过功能评分、Hoechst染色、免疫组织化学、免疫印迹及生化检测等方法,对大鼠脑缺血后神经功能恢复情况、皮层神经元凋亡及氧自由基变化等指标进行观察,明确臭氧自体血回输对大脑中动脉急性缺血后神经功能、凋亡及氧自由基损伤等改善及保护作用,为臭氧自体血回输的广泛应用,进一步奠定理论基础,亦为脑梗死的早期治疗寻找一种有效治疗方法提供新的证据。其次我们对接受臭氧自体血回输治疗的急性脑梗死患者,采用美国国立卫生院神经功能缺损评分(NIH Stroke Scale,NIHSS)、氧自由基生化检测及经颅磁刺激运动诱发电位(Transcranial magnetic stimulation motor evoked potential, TMSMEP)的方法评估,了解臭氧自体血回输治疗对脑梗死患者急性期运动功能恢复的影响以及对脑缺血后氧化应激的作用,进而评估臭氧自体血回输的临床有效性。目的1.通过功能评分、Hoechst染色、免疫组织化学、免疫印迹及氧自由基生化检测等方法,初步探讨臭氧自体血回输对大鼠脑缺血急性期运动功能恢复、缺血脑组织凋亡及氧自由基损伤的影响。2.采用NIHSS评分及MEP的方法评估,明确臭氧自体血回输对急性脑梗死患者临床运动功能恢复的影响。研究方法1.动物实验部分1.1建立臭氧自体血回输治疗大鼠MACO模型及分组选取3月龄250-280g雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,使用线栓法建立MACO模型,给予随机分组,分为假手术组、缺血对照组及缺血治疗组,每组18只。缺血治疗组在术后12h取大鼠尾源静脉血2 ml置于回输专用注射器中,与预先设定的臭氧浓度(47μg/ml)按1：1的比例混合5-10分钟后,将血液经尾源静脉回输,每12小时一次,治疗6次。1.2神经行为学评分在术后12h及第6次臭氧自体血回输治疗12小时后,通过Longa法进行神经行为评分。1.3凋亡检测神经行为学评分后,处死大鼠后取材,通过Hoechst染色、Tunel染色、免疫组织化学及免疫印迹的方法,分别检测缺血皮层的凋亡情况,同时检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-2在缺血脑组织的表达情况。1.4氧自由基的检测神经行为学评分后,处死大鼠后取材,使用相应试剂盒检测缺血脑组织超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(malonaldehyde,MDA)的含量。2.临床试验部分2.1研究对象：试验纳入急性脑梗死患者86例(男58例,女28例),随机分为对照组43例及臭氧治疗组43例。两组基础用药均为拜阿司匹林肠溶片0.3g1/晚+阿托伐他汀钙片20mg,1/晚,臭氧治疗组除药物及康复治疗外给予臭氧自体血回输治疗,1/日,10天一疗程；对照组仅给予药物及康复治疗。2.2病例选择标准：2.2.1入组标准：①年龄在30～80岁之间：②CT或磁共振检查排除脑出血、TIA以及由脑肿瘤、脑外伤、脑寄生虫病、代谢障碍等引起的卒中患者,证实为急性脑梗死患者；③入院后予NIHSS评分,分数在4～20分之间；④发病时间小于72小时大于6小时以上且不能进行静脉溶栓及动脉取栓的患者。2.2.2排除标准：①严重卒中患者,例如多脑叶梗死(CT低密度影大于1/3大脑半球)；②已进行溶栓治疗的患者；③休克、生命体征不平稳、严重心肺并发症及肝肾功能不全患者或预期寿命不超过1个月的；④凝血机能障碍或血小板量及功能异常的患者,地中海贫血、镰状细胞性贫血患者,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症即蚕豆病患者；⑤症状未控制的甲状腺功能亢进；⑥高敏体质；⑦使用激酶类药物、抗自由基制剂的患者；⑧妊娠期或哺乳期妇女；⑨因不适合行MEP检查者：既往安装起搏器及有癫痫病史患者。⑩依从性差,不能遵嘱完成相关检查、治疗、记录的患者。2.3检测方法：2.3.1临床功能评分：分别于治疗前及治疗10天后,对两组患者使用NIHSS评分评估患者临床功能变化。2.3.2氧自由基检测：分别与治疗前及治疗10天后,给予患者抽血,使用生化试剂盒,对患者血清一氧化氮(nitric oxide, NO)、SOD、MDA进行检测。2.3.3 MEP检测：采用KeypointR.net全功能肌电诱发电位仪以及MagPro磁刺激器,进行运动诱发电位检查,刺激线圈为圆形刺激器。患者分别采用仰卧位及坐位,使用磁刺激器在皮层功能区及颈7神经根/腰5-骶1神经根处进行刺激,表面电极记录,记录部位上肢为拇短展肌,下肢为胫骨前肌。3.统计学方法：采用SPSS 16.0软件进行统计分析,正态分布数据以(x±s)表示,以“M(QR)”表达呈偏态分布的数据。计数资料比较采用χ2检验；等级资料采用等级相关秩和检验；计量资料,组内比较采用配对t检验,治疗前后组间趋势比较采用多因素方差分析,方差不齐采用Wilcoxon秩和检验；指标间相关性分析采用spearman秩相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。结果：1.动物实验结果1.1神经行为学评分给予线栓法制作的MCAO大鼠,神经行为学评分均在1-3分。在治疗3天后,缺血对照组及缺血治疗组较术后12h的评分明显下降(P<0.05),缺血治疗组较缺血对照组评分下降更明显(P<0.05)。1.2凋亡检测1.2.1 Hoechst染色：观察治疗3天后的各组缺血皮层细胞的Hoechst染色,可以看到大量的细胞核呈致密浓染,或呈碎块状致密浓染,颜色发白。计算各组凋亡率,缺血治疗组凋亡率较缺血对照组比较明显下降[(39.20±5.12)% vs(45.82±4.89)%](P<0.05)。1.2.2 Tunel染色：观察治疗3天后的各组缺血皮层细胞的染色,荧光下可看到大量细胞,体积缩小,呈三角形或扇形,细胞核固缩深染。通过IPP软件分析,缺血治疗组染色阳性区域的相对面积明显小于缺血对照组[(3.01±0.92)% vs(3.91±0.30)%],缺血治疗组免疫组化染色强度也明显小于缺血对照组(28083.33±7846.55 vs 37754.75±7028.85),均具有统计学差异(P<0.05)。1.2.3凋亡相关蛋白的检测：1)免疫组织化学染色：显微镜下观察结果显示,各组大鼠脑组织Bcl-2、 Bax、Caspase-2的阳性细胞染色均以胞浆有棕黄色物质沉积为主,也有部分胞膜及核膜着色。缺血治疗组较缺血对照组比较,Bcl-2染色阳性区域的相对面积明显增高[(2.36±0.34)%vs(1.66±0.26)%](P<0.01),免疫组化染色强度明显增高[(4741.40±408.76)vs(7464.90±2441.29)](P<0.05)；缺血治疗组Bax染色阳性区域的相对面积较对照组明显减小[(2.41±0.58)%vs(3.59±1.10)%](P<0.05), 免疫组化染色强度检测结果未见明显统计学差异[(20526.69±5473.95)vs(23916.83±7291.13)](P>0.05)。缺血对照组及缺血治疗组的Caspase-2免疫组织化学染色分析未见明显差异[(1.57±0.38)%vs(1.90±0.30)%][(10017.86±2221.08)vs(10222.43±1257.99)](P>0.05)。2)Western Blot蛋白电泳及灰度值检测Western Blot蛋白电泳及灰度值检测后,给予内参校正后比较,显示缺血治疗组Bcl-2灰度值明显高于缺血对照组Bcl-2灰度值(P<0.01),Bax及Caspase-2灰度值明显低于缺血对照组,具有统计学差异(P<0.05)。缺血治疗组Bcl-2/Bax比值较缺血对照组明显增高(P<0.01)1.3氧自由基检测1.3.1缺血脑组织SOD活力水平测定：治疗后,假手术组、缺血对照组、缺血治疗组血浆SOD活力值分别是(5.10±0.78) U/mg.prot, (1.62±0.53) U/mg.prot,(3.26±0.58)U/mg.prot,缺血治疗组、缺血对照组较假手术组下降,数据具有统计学差异(P<0.01),缺血对照组较缺血治疗组明显下降(P<0.01)。1.3.2缺血脑组织MDA活力水平测定：假手术组、缺血对照组、缺血治疗组血浆MDA值分别是(0.45±0.11) nmol/mg.prot, (1.55±0.29) nmol/mg.prot, (0.79±0.16) nmol/mg.prot,缺血治疗组、缺血对照组较假手术组增高,数据具有统计学差异(P<0.01),缺血对照组较缺血治疗组明显增高(P<0.05)。2.临床试验结果2.1急性脑梗死患者的临床功能评分治疗前两组患者NIHSS评分间差异无显著性意义(P>0.05)。治疗10d后,臭氧治疗组与对照组患者NIHSS评分均较治疗前明显下降(P<0.05),臭氧治疗组较对照组明显降低(P<0.05)；臭氧治疗组患者临床总有效率明显高于对照组(P<0.05)。2.2氧自由基相关指标检测：2.2.1血清NO水平测定：治疗前,臭氧治疗组及对照组NO含量分别为(67.30±10.71)μmol/l, (65.74±11.97)μmol/l,治疗10天后,臭氧治疗组及对照组NO含量分别为(48.12±10.59)μmol/l, (53.9±11.55)μmol/l.治疗前,臭氧治疗组及对照组比较无明显统计学差异(P>0.05)；治疗后臭氧治疗组及对照组NO含量均较治疗前明显增高(P<0.01),但臭氧治疗组较对照组明显降低,两组差别有统计学意义(P<0.05)。2.2.2血清SOD水平测定：治疗前,臭氧治疗组及对照组SOD含量分别为(80.52±6.29)U/ml,(82.02±6.34)U/ml,治疗10天后,臭氧治疗组及对照组SOD含量分别为(96.80±8.73)U/ml及对照组SOD(90.45±9.54)U/ml。治疗前,臭氧治疗组及对照组比较无明显统计学差异(P>0.05)；治疗后,臭氧治疗组及对照组SOD含量均较治疗前明显增高(P<0.01),但臭氧治疗组较对照组明显升高,两组差别有统计学意义(P<0.05)。2.2.3血清MDA水平测定：治疗前,臭氧治疗组及对照组MDA含量分别为(9.63±3.98)mnol/ml,(9.58±3.55)nmol/ml,治疗10天后,臭氧治疗组及对照组MDA含量分别为(7.32±3.78)nmol/ml,对照组(6.11±3.60)nmol/ml.治疗前,臭氧治疗组及对照组比较无明显统计学差异(P>0.05)；治疗后,臭氧治疗组及对照组MDA含量均较治疗前明显下降(P<0.01),但比较对照组,臭氧治疗组MDA含量明显下降,两组差别有统计学意义(P<0.01)。2.3臭氧自体血回输治疗急性脑梗死患者神经功能及运动诱发电位相关研究2.3.1臭氧治疗后急性脑梗死患者受试者临床总有效率变化：治疗前两组患者NIHSS评分差异无显著性意义(P>0.05)。治疗10天后,臭氧治疗组与对照组患者NIHSS评分较治疗前相比明显减少(P<0.05),臭氧治疗组少于对照组(P<0.05)；臭氧治疗组患者临床总有效率明显高于对照组(P<0.05)。2.3.2皮层电位引出率比较：运动诱发电位显示治疗前,臭氧治疗组及对照组皮层电位引出率无显著性差异(P>0.05)。在治疗10天后,臭氧治疗组及对照组上肢及下肢皮层电位引出人数均较治疗前增多,但皮层电位引出人数但臭氧治疗组与对照组比较无明显增高(P>0.05),臭氧治疗组上肢皮层电位引出率较对照组明显增高,下肢皮层电位引出率与对照组比较无明显差异(P>0.05)。3.3治疗前后中枢运动传导时间(central motor conduction time,CMCT)比较：两组上肢及下肢CMCT治疗后均较治疗前明显缩短(P<0.05)。治疗前,臭氧治疗组上下肢CMCT较对照组相比无明显差异(.P>0.05)；治疗后,臭氧治疗组上肢CMCT较对照组上肢明显缩短(P<0.05),臭氧治疗组下肢CMCT较对照组下肢CMCT无明显缩短(P>0.05)。两组上肢及下肢CMCT治疗后均较治疗前明显缩短(P>0.05)。3.4 MEP波幅比较：两组上肢及下肢MEP波幅治疗后均较治疗前明显增高(P<0.05)。治疗前,臭氧治疗组上下肢皮质MEP波幅与对照组相比差异无显著性意义(P>0.05)。治疗后,臭氧治疗组上肢皮质MEP波幅较对照组上肢明显增高(P<0.05),臭氧治疗组下肢皮质MEP波幅和对照组下肢相比无明显差异(P>0.05)。两组上肢及下肢MEP波幅治疗后均较治疗前明显增高(P<0.05)。3.5治疗前后急性脑梗死患者NIHSS 与CMCT、波幅的相关性分析：治疗前后患者NIHSS评分改善程度同上肢CMCT改善程度呈正相关(r=0.782,P<0.05),同上肢MEP波幅呈正相关(r=0.847,P<0.05),同下肢CMCT及MEP波幅无明显相关性(P>0.05)。结论1.臭氧自体血回输治疗大鼠大脑中动脉闭塞可有效改善其神经功能评分；臭氧自体血回输治疗脑缺血能够抑制缺血皮层细胞的凋亡,对凋亡蛋白具有一定影响,通过调节缺血脑组织Bcl-2、Bax凋亡相关蛋白,增加Bcl-2/Bax比值,而改善缺血后临床神经功能。我们认为臭氧自体血回输抑制缺血后凋亡与抑制皮层Caspase-2的相关凋亡程序有关。2.臭氧自体血回输治疗急性脑缺血,可通过调节SOD、NO及MDA等水平抗自由基损伤用,提示臭氧自体血回输可通过对线粒体的保护作用,从而抑制凋亡发生。3.臭氧自体血回输可以明显改善急性脑梗死患者的运动功能,是促进脑梗死患者早期功能恢复的有效的方法。通过相关性分析,我们还认为运动诱发电位中上肢中枢传导时间及波幅较下肢检查更能直接反应患者的临床运动功能情况,表明运动诱发电位可以是评估卒中患者临床运动功能的有效方法。