壳聚糖酶是一种专一性降解壳聚糖的水解酶。壳聚糖酶在工业上，可用于制备功能性甲壳低聚糖，在农业上可作为生物控制剂，提高植物的抗病能力；在生物技术方面，可以用壳聚糖酶并辅以其它手段制备真菌原生质体，为细胞分子生物学提供工具酶。本论文以土壤分离获得的壳聚糖酶产生菌曲霉CJ22-3为基础，对菌种进行了诱变改良、摇瓶培养基和培养条件的优化、10 L发酵罐的扩大培养条件控制、酶的分离提取和纯化、纯化酶的酶学性质和酶解作用模式研究以及酶法制备甲壳低聚糖的工艺研究。主要研究内容和结果如下：1． 通过壳聚糖为唯一碳源的选择性平板筛选培养基的分离筛选，从65份土样中筛选得到了45株产壳聚糖酶菌株；再以透明圈与菌落直径比值的大小，结合摇瓶复筛，采用DNS法和粘度降低法来判定酶活高低；对产壳聚糖酶活力较高的菌株，采用TLC、HPLC、MS法进行酶解产物分析。结果表明：菌株21-3、 22-3的酶解产物相近，均为一糖至五糖；结合菌株的培养特性，选择菌株22-3作为进一步试验菌株，命名为CJ22-3。根据CJ22-3的菌落、顶囊、分生孢子头、分生孢子的特征，确定它为曲霉。对该菌株的发酵液以及酶解所得产品进行急性毒性试验，证明它是安全的。2． 实验发现易利用碳源对野生菌株曲霉CJ22-3产壳聚糖酶产生阻遏；曲霉CJ22-3产生的壳聚糖酶受转录子控制。为此建立了在平板筛选培养基上添加0． 1％Triton-100抑制剂和2％葡萄糖来筛选诱变突变株。以曲霉CJ22-3为出发株，经紫外诱变和60Co诱变，最终获得高产菌株CJ22-326，其产酶活力为出发株的1． 54倍，经培养基优化和发酵条件优化后摇瓶产酶达3． 06 u／ml：在10 L机械搅拌罐上进行放大试验，酶活为3． 65 u／ml，比摇瓶高19％。3． 对曲霉CJ22-326菌株培养液采用减压浓缩和75％乙醇沉淀的方法来提取壳聚糖酶，酶收率达75％以上。该酶经CM-Sepharose FF离子交换色谱、Sephacryl S-200凝胶过滤色谱和Phenyl Sepharose CL-4B疏水色谱分离纯化技术，分离得到两种壳聚糖酶组分ChiA和ChiB，对ChiA和ChiB经SDS-PAGE凝胶电泳鉴定均为单一色带，其相对分子质量分别为106． 2 kDa和29． 0 kDa；采用Sephacryl S-200凝胶过滤色谱测定的相对分子质量则分别为96 kDa和28． 9 kDa，两种方法测定结果基本一致，说明他们是单体酶。对最终纯化的ChiA和Chi B分别采用反相色谱进行纯度分析，其纯度分别达到92％和94％。4． 对两种单体酶的酶学性质进行了系统的研究，结果表明：ChiA和ChiB最适pH分别为4． 2和5． 8，稳定的pH范围分别为pH 4． 0-6． 0和pH 5． 5-7． 5；最适作用温度分别为50℃和65℃，两者在低于50℃保温时，热稳定性都较好，但在高于60℃时，ChiB比ChiA热稳定性要高。2． 5mmol／L的Ag+、Fe3+和1mmol／L的Hg2+对ChiA和ChiB均有较强烈的抑制作用。lmmol／L的Mn2+对ChiA和ChiB均有强烈的激活作用，2． 5mmol／LCu2+、Cd2+、Pb2+对Chi B有抑制作用，其它金属离子对ChiA和ChiB酶活无多大影响。在低底物浓度时，ChiB酶反应能很好地满足米氏方程，表观米氏常数Km为0． 7749 mg/mL，Vmax为0． 272 u／ml；而在底物浓度超过1mg/mL时，反应速度反而随底物浓度升高而下降，即表现出底物抑制作用。 摘要ChiA酶反应能很好地满足米氏方程，米氏常数Km为8.7494mg/inl，Vmax为0.778 u/ml。ChiA和Ch沮具有高度的底物专一性，除了对不同脱乙酞度的壳聚糖有作用以外，对几丁质和CMC没有水解活力。两者的反应速率均随底物脱乙酞化度的提高而增加。 5.通过测定酶解液体系粘度和对酶解产物的TLC、1于LC分析，在国内首次深入地研究并报道了内切、外切壳聚糖酶的酶解作用模式，结果表明:酶ChiB是一种内切酶，以内切方式水解壳聚糖的p一(1，4)糖昔键，即作用于GlcN一GlcN、GlcN一GlcNAc和域GlcNAc一GlcN糖昔键，不能作用于GlcNAc一GldNAc糖昔键;酶解终产物以壳三糖、壳四糖、壳五糖为主。以低聚糖为底物的水解产物分析表明，壳五糖是可以适当速率进行水解的最低聚合度的底物，水解产物为壳二糖和壳三糖，壳六糖主要被水解成壳三糖。酶ChiB不水解壳四糖，对壳五糖的水解速率较慢，这一特点非常有利于用它来生产聚合度相对高的壳寡糖。酶ChiA是一种外切氨基葡萄糖昔酶，主要从壳聚糖或壳低聚糖分子一端(非还原端)依次切下氨基葡萄糖残基。它只作用于GlcN一GlcN和GlcN一Gl创NAe糖昔键，不能作用于GleNAe一GlcN和Gl比认c一GlcNAc糖昔键。 6.以不同脱乙酞化度的壳聚糖为原料，采用曲霉发酵液超滤(膜分子截留值50000)后的内切酶进行酶法制备甲壳低聚糖，形成了甲壳低聚糖酶法生产新工艺。其优化工艺条件为:水解底物浓度为3%左右，pHS.o一5 .8，酶用量在4一6可g壳聚糖。采用Na0H溶液调PH至8左右，在波长600Inn下测其透光率，当透光率达到78%左右，即可终止酶解反应，该方法可方便、快速和准确地控制酶解反应。甲壳低聚糖产品得率达94%以上。该产品理化指标为水溶性99.5%以上，无单糖，聚合度在3以上，灰分0.6%