沙门菌(Salmonella)为革兰氏阴性杆菌,是一种重要的食源性人兽共患病原菌。在世界各地的食物中毒中,沙门菌引起的中毒病例占首位或第二位,其中污染的禽肉和蛋类食品是感染的主要来源。在我国,污染的禽蛋和禽肉亦是沙门菌的主要来源之一。然而还缺乏完善的定量监测数据。2002年WHO/FAO开展的关于鸡蛋和鸡肉中沙门菌的风险评估称,如果鸡肉中沙门菌污染率低于0.05%,则沙门菌发病率几乎为零。许多国家据此制定了鸡肉中沙门菌的限量标准,我国目前制定的限量标准是不得检出,但是该标准并不是根据定量风险评估制定的,因此有必要对鸡肉中沙门菌进行定量检测,为鸡肉沙门菌定量风险评估以及鸡肉源沙门菌病的防治提供基础流行病学数据。肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌是引起人类食源性沙门菌病的主要血清型,由于其血清型间的高度同源性,传统的分型方法并不能有效地对其进行亚型分型。CRISPRS基因存在于大部分原核生物中,包括沙门菌。由于进化速度很快,即使相同血清型菌株间的CRISPRS基因也存在显著的序列差异性,非常适合于相同血清型菌株间的亚型分型。而且CRISPRS分型方法在数据分析、输出、标准化、解释和数据交换方面要优于现行的分型方法。因此选用CRISPRS分型方法对肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌分离株进行亚型分型分析。本研究的主要内容和目的是：(1)鸡肉中沙门菌污染水平的定量分析,(2)沙门菌分离株CRISPRS分子亚分型分析。一、鸡肉中沙门菌污染水平的定量分析本研究使用国家食品安全风险评估中心改进的MPN(most probable number)方法,该方法包括样品采集、样品漂洗、前增菌、选择性增菌、接种XLT4平板、XLT4平板纯化、生化鉴定等,最终用MPN/g表示阳性样品中沙门菌带菌量。2011-2012年期间,共检测240份整鸡。定性检测结果分析显示,在240份整鸡中共检出阳性81只,阳性率为33.75%。120只现宰杀活鸡,检出阳性36只,阳性率为30%；60只冷冻鸡,检出阳性21只,阳性率为35%；60只冷藏鸡,检出阳性24只,阳性率为40.0%。冷藏鸡沙门菌阳性检出率最高(40.0%)。78株沙门菌分离株包含25种血清型,优势血清型为鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌,分别检出27株(34.6%)和13株(16.7%)。本研究参照国家食品安全风险评估中心的方法,将沙门菌带菌量分成<0.1、0.1-0.2、0.2-0.5、0.5-1、1-2、2-5、>11七个区间。定量检测结果分析显示,81只阳性鸡中,53(65.43%)只阳性鸡沙门菌带菌量小于0.1MPN/g,8(9.88%)只阳性鸡沙门菌带菌量在0.1MPN/g-0.2MPN/g之间,8(9.88%)只阳性鸡沙门菌带菌量在0.2MPN/g-0.5MPN/g之间,3(3.7%)只阳性鸡沙门菌带菌量在0.5MPN/g-1MPN/g之间,2(2.47%)只阳性鸡沙门菌带菌量在1MPN/g-2MPN/g之间,4(4.94%)只阳性鸡沙门菌带菌量在2MPN/g-5MPN/g之问,3(3.7%)只阳性鸡沙门菌带菌量大于11MPN/g。2002年中国居民营养与健康状况调查显示,我国居民每次平均消费鸡肉50克,而文献报道人体一次性食入105MPN沙门菌时可能致病,即沙门菌带菌量达到2MPN/g时可能致病,本研究中有7(8.64%)只阳性鸡沙门菌带菌量达到了致病量。依据此次监测数据分析显示,阳性冷冻鸡沙门菌带菌量平均值为0.282MPN/g,标准误sem为0.154；阳性冷藏鸡沙门菌带菌量平均值为0.213MPN/g,标准误sem为0.104；阳性现宰杀活鸡沙门菌带菌量平均值为0.099MPN/g,标准误sem为0.038。不同储存方式阳性整鸡中沙门菌带菌量无显著差异,P>0.05。阳性包装整鸡中沙门菌带菌量平均值为0.252MPN/g,标准误sem为0.107；阳性未包装整鸡中沙门菌带菌量平均值为0.165MPN/g,标准误sem为0.066。不同包装形式阳性整鸡中沙门菌带菌量无显著差异,P>0.05。超市阳性整鸡沙门菌带菌量平均值为0.250MPN/g,标准误sem为0.107；农贸市场阳性整鸡沙门菌带菌量平均值为0.099MPN/g,标准误sem为0.038。不同销售地点阳性整鸡中沙门菌带菌量无显著差异,P>0.05。-18℃储存的阳性整鸡中沙门菌带菌量平均值为0.282MPN/g,标准误sem为0.154；4℃储存的阳性整鸡中沙门菌带菌量平均值为0.213MPN/g,标准误sem为0.104；室温储存的阳性整鸡中沙门菌带菌量平均值为0.099MPN/g,标准误sem为0.038。不同储存温度阳性整鸡中沙门菌带菌量无显著差异,P>0.05。二、沙门菌分离株CRISPRS分子亚分型分析肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌是肠道沙门菌中最常见的血清型,由于血清型的高度同源,目前大多数分型方法对其区分能力很低,不能满足进一步分型的需要CRISPRS(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)序列属于新的DNA重复序列家族,在沙门菌中具有高度多态性,通过比较菌株间的spacers差异,能够区分高度同源的血清型。本研究对肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌分离株进行CRISPRS分子亚分型分析。分离株特性分析显示,同源性较高的相同血清型间的CRISPRS基因可能存在一定的差异。宿主来源相同的同一血清型间的CRISPRS基因可能存在一定的差异。不同地点宿主来源相同的同一血清型间的CRISPRS基因可能相同。同一地点宿主来源相同的同一血清型间的CRISPRS基因可能存在一定的差异性。分析结果表明CRISPRS基因在同一血清型间具有高度的多态性,对于相同血清型分离株的菌株特性以及进化关系分析具有重要作用。亚型分型结果显示,29株鼠伤寒沙门菌分成了A、B、C三个谱系,谱系A又分成了A1、A2、A3、A4、A5五个支系,谱系B又分成了B1、B2、B3三个支系；14株肠炎沙门菌分成了D、E两个谱系,谱系D又分成了D1、D2、D3三个支系。CRISPRS方法成功地对肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌进行了分型,表明该方法对同源性较高的同种血清型具有较高的分型能力和较好的区分效果。基于CRISPRS基因的高度多态性,其在沙门菌分离株的比较、相同血清型菌株间的亚分型、菌株特异性检测方面具有广阔的前景。