生物乙醇作为一种清洁的可再生能源被多数国家纳入发展战略规划。廉价的原料是燃料乙醇工业化生产的必要条件,利用可再生植物纤维资源制取乙醇成为当前的研究热点。木糖是木质纤维素水解产物中含量仅次于葡萄糖的单糖,将木糖发酵生成乙醇,可提高纤维素转化乙醇的效率,从而降低生产成本,促进燃料乙醇生产工业化。迄今发现的微生物或构建的工程菌株,木糖发酵乙醇的生产性能仍然不能达到工业化生产的要求,因此,筛选性能优良的木糖发酵菌株和研究微生物木糖代谢工程成为该领域的研究重点。　　 本文主要研究内容是从嗜热厌氧乙醇杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicusJW200)基因组DNA中克隆木糖转运和代谢相关基因,并对相应操纵子进行序列分析；对木糖异构酶进行表达纯化及酶学性质的分析；利用Red重组方法将木糖转运及代谢操纵子整合到大肠杆菌基因组,研究重组菌株利用木糖的能力。　　 1.从嗜热厌氧乙醇杆菌基因组中克隆了包括木糖转运操纵子在内的9个基因,通过序列分析确定了木糖转运操纵子包括xylF,xylG和xylH三个基因,并对木糖转运操纵子的转录调控序列进行了分析。　　 2.构建了携带木糖转运操纵子的整合质粒,利用RED重组系统,将嗜热厌氧乙醇杆菌来源的木糖转运操纵子整合到大肠杆菌基因组D型乳酸脱氢酶位点,同时敲除D型乳酸脱氢酶基因,获得了整合菌株E.coli K12(ΔDldh::xylFGH)；整合菌株E.coli K12(ΔDldh::xylFGH)能够在以木糖为唯一碳源的M9培养基中生长,而且生长趋势比野生型菌株E.coli K12要好。　　 3.从嗜热厌氧乙醇杆菌基因组中克隆了木糖代谢操纵子(xylAB)以及上游基因xylAlike,其中xylAlike作为木糖代谢操纵子上游基因与其他嗜热厌氧菌株有很大的差异性；并对木糖代谢操纵子的转录调控序列进行了分析。　　 4.在大肠杆菌中成功表达了木糖异构酶(XylA),通过热处理和阴离子交换柱两步纯化后,酶纯度达到电泳均一。纯化的XylA最适反应温度为85℃,最适pH为7.0,在pH6～10之间有良较好的稳定性,1 h半衰期温度为85℃。当XylA催化木糖时,Co2+、Mn2+和Mg2+对其活性有很大的激活作用:催化葡萄糖时,Co2+和Mg2+对其活性有很大的激活作用。以D-木糖为底物,XylA的米氏常数Km为11 mM,酶促最大反应速率Vmax为25U／mg。　　 5.构建了携带木糖代谢操纵子的整合质粒,利用Red重组系统,以E.coliK12(ΔDldh::xylFGH)为宿主菌,将嗜热厌氧乙醇杆菌来源的xylAB整合到E.coliK12(Δ Dldh::xylFGH)自身的xylAB位点,同时沉默xylAB和xylFGH操纵子,获得了整合菌株E.coli K12(ΔDldh::xylFGH,ΔxylAB::TxylAB)。整合菌株E.coliK12(△Dldh::xylFGH,△xylAB::TxylAB)在以木糖为唯一碳源的M9培养基中只能微弱生长。