阿尔茨海默病(Alzheimers disease,AD)是一种常见于老年人的神经系统变性疾病,是老年人痴呆中最常见的病因.临床上以进行性的记忆、认知功能减退和精神障碍为特征,给家庭和社会带来巨大的负担.神经炎性斑(neuritic plaque),又称老年斑(senile plaque),是AD特征性的病理改变之一.神经炎性斑的主要成分是一种由39～43个氨基酸残基组成的称为β淀粉样蛋白(β amyloid,Ap)的肽类物质在细胞外沉积,从而对细胞造成毒性,导致患者脑的高级功能障碍.海马和皮层等处胆碱能神经元功能受损被认为是患者记忆和认知障碍的主要原因,因此减少Aβ的沉积/生成或者促进其清除已成为AD治疗的重要策略之一. 脑内Aβ来源于其前体物质一一淀粉样前体蛋白(amyloid precursorprotein,APP).根据APP在体内是否产生Aβ,APP在体内有两条代谢途径:(1)β分泌酶代谢途径:APP先在Aβ序列的第一位氨基酸部位经p分泌酶(β-secretase,又称β-site amyloid cleavage enzyme 1,BACE1)水解,产生一大的N末端片段(sAPPβ)和小的跨膜片段(C99),后者再经γ分泌酶(γ-secretase)在Aβ序列的第40/42位氨基酸部位作用,产生39～42个氨基酸的肽段--Aβ和另-胞内片段AICD(APP intracellular domain,AICD),已有较多的实验结果提示,Aβ可对细胞产生毒性作用.(2)α分泌酶代谢途径:APP先由α分泌酶(α-secretase)在Aβ序列的16～17位氨基酸之间水解,产生较大的N末端片段(sAPPα)和一跨膜片段(C83),后者同样经丫分泌酶作用产生较小的片段p3和AICD.在α分泌酶代谢途径中,由于α分泌酶从Aβ分子内部进行分解,避免了完整Aβ分子序列的产生,且sAPPα可对神经细胞产生神经营养和神经保护作用.如果有较多的APP分子经第二条途径代谢,由于体内APP分子的量是一定的,那么经β分泌酶途径代谢的底物APP分子减少,理论上Ap的分泌就会减少,这对AD的治疗来讲是十分有利的.因此如何调节APP的代谢,即如何增加sAPPα的分泌和/或减少Aβ的分泌已成为AD研究的重要内容. 蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)是多基因家族的蛋白酶,已有较多的研究表明,PKC在AD的发生、发展过程中起着一定的作用.在AD患者的成纤维细胞发现PKCα单体缺陷;Aβ能够降低PKC亚型的表达;PKC在记忆和认知过程中所起的作用已经在动物模型得到证实.除此之外,PKC对APP代谢的影响也得到了人们的关注.PKC激动剂佛波醇酯(phorbol esters)可以影响APP的代谢:使sAPPα分泌增多,Aβ释放减少,提示其有可能对AD具有治疗作用.但是其具有致癌性而限制了其应用. 考虑到 APP 代谢异常在AD发病机制中的地位,以及sAPPa和Aβ在AD发生、发展过程中的不同作用,如果能够找到一个降低Aβ且增加sAPP分泌又无致癌性的小分子物质无疑对研究AD的治疗具有重要意义.本研究的主要目的是观察一种新型的PKC激动剂(2S,5S)-(E,E)-8-(5-(4-(trifluoromethyl)phenyl)-2,4-pentadienoylamino)benzolactam(简称TPPB)在体外对APP代谢的影响,从而探讨其对AD潜在的治疗作用. 本研究利用 SH-SY5Y 细胞和PC12细胞,采用W estern Blot、ELISA、免疫组化、酶活性测定等方法,得到如下结果: 1、TPPB对APP代谢的影响:在0.1～10 μmol/L 的浓度范围内 (对细胞无明显的毒性作用),TPPB在SH-SY5Y细胞能够增加sAPPα的分泌,而对细胞本身 APP 的表达无显著影响;对PC12细胞,TPPB也能够在不显著影响细胞 APP 表达的前提下增加sAPPα的分泌. 2、TPPB对PKC的激活作用:Western Blot和免疫细胞化学结果均显示TPPB使PKCa,β,δ,ε,亚型在膜部分表达增加,而使其在相应的胞浆部分表达减少;对PKCγ和ζ亚型的亚细胞分布状态无显著影响;TPPB作用细胞后使P-PKC及其底物P-MARCKS水平升高,且能被PKC的抑制剂所抑制. 3、TPPB对α分泌酶的作用:酶活性检测结果显示,1 μmoVL的TPPB作用PCI2或者SH-SY5Y细胞3 h后均使α分泌酶活性升高,其中在SH.SY5Y细胞α分泌酶活性是对照组的130﹪(P<0.05); TPPB能够促进ADAM10分子活性形式的表达,而对酶原形式的表达影响不大;对ADAMl7分子,TPPB不但增加酶原形式的表达,而且显著-增加了其活性形式的表达; 给予PC12细胞或者SH-SY5Y细胞lmol/L的TPPB均使sAPPa分泌增加,而这种增加能够被金属蛋白酶抑制剂TAPI-2,furin抑制剂CMK和蛋白转运抑制剂brefeldin所抑制. 4、TPPB引起sAPPa分泌增加所涉及的信号转导通路:在TPPB作用于细胞同时给予特异性的信号转导激酶抑制剂,结果显示,TPPB引起sAPPa分泌增加的作用可被PKC,ERK,JNK和酪氨酸激酶特异性的抑制剂所抑制,说明这些信号转导途径介导了其对sAPPa分泌的作用. 5、TPPB对p分泌酶的作用:ELISA检测结果表明,TPPB作用于SH-SY5Y细胞后能够降低Aβ40的分泌.β分泌酶活性检测显示,1μmol/L的TPPB处理SH-SY5Y细胞3小时后,β分泌酶的活性降低至对照组的75.65±10.56﹪(P<0.05);l μmoFL的TPPB作用3小时后降低了β分泌酶(β-site APP cleaving enzyme 1,BACEl)的表达;而TPPB处理细胞3小时后均未显著影响Ap降解酶NEP和IDE的表达. 综上,本研究表明: 1、PKC激动剂TPPB可以影响APP的代谢,具体表现为增加sAPPα分泌和降低Ap40的分泌,使其向着对AD的治疗非常有利的方向进行. 2、TPPB调节APP的代谢主要通过提高α分泌酶活性和/或降低β分泌酶的活性的机制来实现.