过度施用氮肥不仅会带来环境污染等问题,还会影响作物的品质,因此合理施用氮肥、提高氮肥利用率显得尤为重要。研究短期氮缺乏下黄瓜叶片抗坏血酸代谢途径中关键基因的表达情况,为解析黄瓜响应氮胁迫的分子机制提供了依据,同时为适量施氮提供一定的理论基础。本实验采用营养液栽培,以黄瓜9930的水培植株为试验材料,在黄瓜植株展开第五片真叶开始进行48 h氮缺乏处理。实验共设两个处理:缺氮(ND),N浓度为0 mM;CK,N浓度为12 mM。对植株抗氧化酶活性、抗坏血酸(AsA)含量、AsA合成底物、AsA合成代谢相关基因表达及酶活性进行研究,预测关键基因并通过瞬时表达实验进行功能验证。实验结果如下:1、黄瓜抗氧化酶系统响应氮胁迫。与CK相比,丙二醛浓度显著升高,48 h处上调约30%;过氧化氢浓度在处理12和48 h分别升高约16%和34%;超氧阴离子产生速率显著上调,处理48h时升高约一倍;植株内抗氧化酶(SOD,POD,CAT)和APX活性显著上调。黄瓜叶片内抗氧化酶系统受到氮胁迫的诱导。2、氮胁迫诱导黄瓜叶片抗坏血酸含量升高。缺氮叶片的抗坏血酸和总抗坏血酸浓度显著高于对照,48 h处变化幅度最大,分别升高约48%和36%。黄瓜叶片内抗坏血酸受到氮胁迫的诱导。3、氮胁迫诱导黄瓜AsA-GSH循环相关基因表达及酶活性的变化。处理后催化AsA还原再生的MDHAR和DHAR活性显著下降,MDHAR2、MDHAR3、MDHAR4和DHAR2基因表达量显著下调;AsA降解过程中的AO2、GR2表达水平在缺氮叶片中普遍下调,AO2最大下调约0.15倍,GR2最大下调约0.5倍,AO和GR活性显著低于对照。AsA降解过程速度的减慢有利于AsA累积,因此AsA-GSH循环中的AO和GR在氮胁迫诱导AsA含量升高的过程中起到一定作用。4、氮胁迫诱导黄瓜AsA生物合成途径中肌醇途径相关基因表达及酶活性变化,MIOX1可能是肌醇途径中受到氮胁迫诱导的重要基因。肌醇途径关键酶(MIOX、GL,GLR)基因表达量和酶活性均显著上调;其余AsA合成途径相关酶(GMP,GLDH,GalUR)活性处理后变化不显著甚至下调,基因表达量变化与其一致;AsA合成底物肌醇浓度处理6 h显著上升约20%,之后持续下降。MIOX1的表达量变化幅度较大,与CK相比,处理6 h时上调约30倍,其余基因变化幅度相对较小,上调倍数均小于10。肌醇途径在氮胁迫下变得活跃,MIOX1可能在肌醇途径中受到氮胁迫诱导的重要基因。5、瞬时表达实验证明MIOX1是调控抗坏血酸合成的基因。在烟草中瞬时表达黄瓜MIOX1基因,发现烟草植株抗坏血酸含量显著升高,比野生型植株增加约34%。说明黄瓜MIOX1具有调控抗坏血酸合成的功能。综上,氮胁迫诱导黄瓜植株抗氧化酶活性和AsA含量显著升高,AsA-GSH循环中的AO和GR及AsA生物合成途径中肌醇途径相关酶能够响应氮胁迫,MIOX1是肌醇途径中受到氮胁迫诱导的重要结构基因。