背景和目的百草枯(Paraquat,PQ)中毒仍然是较高发的农药中毒事件,尤其是在中国等亚洲国家。百草枯在肺内大量积聚,早期出现急性肺损伤(Acute lung injury,ALI),继而发生不可逆的肺纤维化改变,最终导致患者死亡。但是百草枯中毒导致肺纤维化的确切机制仍没有完全阐明。目前的研究表明上皮-间质转化可能是肺纤维化的一条重要途径。我们研究小组的前期研究表明,缺氧诱导因子-1alpha(HIF-1α)在百草枯中毒诱导的上皮-间质转化中起到了重要的作用。有多种研究表明,HIF-1α能诱导上皮-间质转化。我们的前期研究表明HIF-1α通过正反馈调节促使肺泡II型上皮细胞表达间质标志物如α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),促进了胶原的沉积,导致了肺纤维化。他汀即3-羟基-3甲基戊二酰辅酶A(HMG-Co A)还原酶抑制药,是经典的降脂药物。同时,他汀是冠心病的一线预防药物和缺血性卒中的二线预防药物。他汀除了降血脂和稳定血管内膜斑块的作用外,还有很多其他的生理效应,这些多效性是他汀作为胆固醇合成抑制剂和异戊二烯合成抑制剂的作用的结果。他汀类药物可提高血管内皮功能,减少活性氧化剂的数量,并可以改善某些疾病的病理生理反应,降低前炎症因子的表达、调节免疫、稳定内皮斑块、调节交感神经兴奋性、降低凝血瀑布活性、抑制血小板黏附等等。已经有很多研究表明他汀在许多常见的肺部疾病中发挥治疗作用。他汀可以通过改善细胞功能抑制炎性反应起到治疗作用。研究表明他汀也有调节HIF-1α表达从而发挥生物学效应。且既往的研究中有报道在大鼠体内实验中使用最常见的药物阿托伐他汀(ATS)治疗后,百草枯所导致的肺纤维化程度有所减轻。因此我们推测阿托伐他汀可能能够通过调控HIF-1α表达,从而调节上皮-间质转化,改善百草枯中毒导致的肺纤维化。方法1.ATS可以减轻百草枯中毒导致的肺损伤和肺纤维化(1)建立PQ中毒的大鼠模型,分为对照组,PQ组,PQ+ATS 20mg/kg组,和PQ+ATS 40mg/kg组。利用HE染色观察肺组织的炎性细胞浸润情况,MASSON染色观察肺组织中胶原沉积现象。定量测定肺组织中羟脯氨酸含量,以评定肺组织胶原含量和纤维化程度。2.ATS可能有抑制PQ诱导上皮-间质转化中的作用(1)建立PQ中毒大鼠模型,分为对照组,PQ组,PQ+ATS20mg/kg组,和PQ+ATS40mg/kg组。利用Western Blot检测不同组别肺组织中上皮标志物紧密连接蛋白(ZO-1)和钙粘蛋白(E-Caderin)以及间质标志物紧密α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和波形蛋白(Vimentin)的表达情况。并利用免疫组化方法检测不同组别肺组织中间质标志物α-SMA的表达。(2)检测不同浓度ATS对于A549细胞株,RLE-6TN细胞株的细胞毒性作用,选择合适的ATS浓度作为体外实验浓度。(3)利用A549,RLE-6TN细胞株建立体外PQ中毒模型,分为PQ组,PQ+ATS低剂量组,PQ+ATS高剂量组,用Western Blot检测不同组别细胞中上皮标志物ZO-1和E-Caderin和间质标志物α-SMA和Vimentin的表达情况。(4)利用A549,RLE-6TN细胞株建立体外PQ中毒模型,分为PQ组,PQ+ATS低剂量组,PQ+ATS高剂量组,显微镜下观察细胞形态改变。(5)利用A549细胞株建立体外PQ中毒模型,分为PQ组,PQ+ATS低剂量组,PQ+ATS高剂量组,利用免疫荧光观察上皮标志物ZO-1和间质标志物α-SMA的变化。3.ATS可能通过调控HIF-1α/β-catenin的表达抑制上皮-间质转化(1)建立PQ中毒大鼠模型,分为对照组,PQ组,PQ+ATS20mg/kg组,和PQ+ATS40mg/kg组。利用Western Blot检测不同组别肺组织中HIF-1α,β-catenin表达情况。并利用免疫组化检测不同组别肺组织中HIF-1α表达情况。(2)利用A549,RLE-6TN细胞株建立体外PQ中毒模型,分为PQ组,PQ+ATS低剂量组,PQ+ATS高剂量组,利用Western Blot检测细胞株HIF-1α表达变化。(3)利用A549,细胞株建立体外PQ中毒模型,分为PQ组,PQ+ATS低剂量组,PQ+ATS高剂量组,免疫荧光观察细胞中HIF-1α表达变化。结果1阿托伐他汀减轻百草枯中毒导致的肺损伤和肺纤维化(1)SD大鼠体内模型HE染色显示,他汀组对比百草枯组,炎性细胞浸润程度明显减轻。尤其是在72小时更加明显。MASSON染色显示胶原的沉积在24h、72h和168h的时候胶原沉积有不同程度减轻。(2)SD大鼠体内模型中,他汀干预组羟脯氨酸定量测定显示其沉积在24h、72h和168h的时候较PQ染毒组明显减轻。而在168h的时候,PQ+ATS40mg/kg组比PQ+ATS20mg/kg组的羟脯氨酸沉积明显减轻。2.ATS抑制PQ诱导上皮-间质转化中的作用(1)SD大鼠体内模型中,他汀组对比百草枯组,Western Blot显示他汀组的的上皮标志物E-Cadherin,ZO-1表达增加,间质标志物Vimentin,α-SMA表达减少,且高剂量ATS组明显。免疫组化显示α-SMA表达减少。且高剂量组更明显(2)在A549,RLE-6TN细胞株细胞株体外模型中Western Blot显示他汀组的的上皮标志物E-Cadherin,ZO-1表达增加,间质标志物Vimentin,α-SMA表达减少,且高剂量ATS组明显。(3)在A549细胞株体外模型中免疫荧光显示,他汀组的的上皮标志物ZO-1表达增加,而间质标志物α-SMA表达减少。(4)在A549细胞株和RLE-6TN细胞株体外模型中,可以看到PQ诱导上皮细胞梭形化,而他汀可以减轻细胞梭形化。3.ATS通过降低HIF-1α/β-catenin的表达抑制上皮-间质转化(1)在SD大鼠的体内模型中,对比PQ组,Western Blot方法检测显示,ATS组HIF-1α的表达降低。(2)在SD大鼠的体内模型中,对比PQ组,免疫组化方法检测显示,ATS组HIF-1α的表达降低。(3)在A549,RLE-6TN细胞株体外模型中,对比PQ组,Western Blot方法检测显示,ATS组HIF-1α的表达降低,β-catenin的表达降低。(4)在A549细胞株体外模型中,对比PQ组,免疫荧光方法检测显示,ATS组HIF-1α的表达降低。结论阿托伐他汀可以减轻百草枯中毒导致的肺纤维化。其机制可能是阿托伐他汀通过降低HIF-1α/β-catenin的表达,从而抑制了上皮-间质转化,减轻了肺纤维化的程度。