基于抗铬基因和亚硫酸盐还原酶特性的优势菌除铬机理研究

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细菌质粒往往与重金属抗性机制具有密切关系,而亚硫酸盐还原酶在重金属的去除过程中也起到关键的作用。因此,本文从抗性质粒和还原酶角度研究两株前期筛选得到的优势菌的除铬(Ⅵ)机理。通过质粒诱导、质粒提取、质粒去除和质粒转化等试验对菌株质粒的特性进行研究,确定铬(Ⅵ)抗性与菌株质粒、质粒拷贝数与铬(Ⅵ)去除率之间的关系;通过铬(Ⅵ)对优势菌的产酶效率、酶活的影响,以及菌株亚硫酸盐还原酶特性与除铬(Ⅵ)效率的相互关系研究,探究亚硫酸盐还原酶与铬(Ⅵ)去除之间的相关性,确定铬(Ⅵ)负荷与亚硫酸盐还原酶的酶活性、产酶效率的关系。通过耐受性试验发现,两株除铬优势菌对铬(Ⅵ)表现出较高的耐受性,耐受浓度分别为80mg/L和100mg/L,而且从两株菌的生长曲线看出,B菌对铬(Ⅵ)的适应性更好,在0-100mg/L的铬(Ⅵ)环境中,只经过4h左右的停滞期便进入对数生长期,而A菌在60-80mg/L的铬(Ⅵ)中,经过20h左右的适应之后才进入对数生长期,同时,生长曲线显示B菌生长速率略低于A菌,但是在相同培养条件下,两株菌的最大生长量差别不明显。采用碱裂解法对两株除铬优势菌进行质粒提取,并经过琼脂糖凝胶电泳鉴定,确证两株菌都具有质粒,且为闭合环状,分子量为23kb。铬(Ⅵ)诱导试验发现:铬(Ⅵ)浓度为60-100mg/L时,铬(Ⅵ)浓度与质粒拷贝数和菌株除铬(Ⅵ)率均呈正相关性,而且随着质粒拷贝数的提高,A菌的铬(Ⅵ)去除率从29.9%提高到46.9%,B菌的铬(Ⅵ)去除率则从29.6%提高到43.4%,从而证明了菌株质粒很大程度上决定了菌株的除铬效率;以30mg/L SDS对菌株进行质粒去除,丢失质粒的菌株在铬(Ⅵ)浓度为20mg/L的培养基上不能生长,说明其失去了抗铬(Ⅵ)能力,因此说明两株菌的铬(Ⅵ)抗性基因或受到质粒的控制或位于质粒上。将从两株菌中提取的质粒分别转化质控菌大肠杆菌内,获得质粒后的大肠杆菌对铬(Ⅵ)的耐受性也分别达到80mg/L和100mg/L,确定了两株菌的铬(Ⅵ)抗性基因位于菌株质粒上在亚硫酸盐还原酶的研究中发现,120mg/L以下的铬(Ⅵ)对酶活性没有抑制作用,铬(Ⅵ)在120-200mg/L时,酶活性呈现出下降的趋势,但是对酶活性的抑制作用很小,酶活性下降了20%左右,当铬(Ⅵ)浓度为400-1000mg/L时,亚硫酸盐还原酶酶活性受到明显的抑制作用,酶活力降低至原来的2.1%。研究也发现,在不对产酶菌株生长造成抑制的前提下,铬(Ⅵ)对菌株发酵产亚硫酸盐还原酶没有产生影响,且亚硫酸盐还原酶的存在有利于提高铬(Ⅵ)的去除效果,而且单一还原酶也具有除铬(Ⅵ)作用,当铬(Ⅵ)浓度低于200mg/L时,菌株亚硫酸盐还原酶除铬()率在10%左右,当铬(Ⅵ)浓度为400-1000mg/L时,酶活性受到抑制,除铬(Ⅵ)率只有1%左右,铬(Ⅵ)负荷低于200mg/L时,亚硫酸盐还原酶能够有效提高铬(Ⅵ)的去除效果。因此,两株菌的抗铬(Ⅵ)特性与其质粒携带的抗性基因有关,同时,两株菌能通过形成亚硫酸盐还原酶,在铬(Ⅵ)去除过程中能够发挥重要的催化作用。
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