一.目的胆道并发症严重影响肝移植受体的生存及生活质量,被公认为肝脏移植的薄弱环节(Achilles’heel)。随着人们对胆道并发症认识的深化和外科吻合技术的提高,由外科技术原因造成的胆管吻合口并发症及引流管相关性并发症的发病率呈下降趋势,而以非外科技术因素所导致的胆道并发症仍然是制约肝脏移植远期疗效的主要因素之一。以弥漫性或局灶性的移植物胆管树狭窄、扩张、毁损及管型形成为病理特征的缺血型胆管病变(ITBL)是非外科性移植物胆管并发症的主要类型[1],发生率为2%-19%。尽管公认冷保存/再灌注损伤(CPRI)是其发病的主要原因,但具体机制尚不清楚。近年来,疏水性胆盐在胆道损伤中的作用受到人们的重视。疏水性胆盐既可以通过“去垢”作用干扰生物膜的脂代谢,也可以诱导细胞凋亡,具有很强的细胞毒性[2]。人的胆盐池95%以上由疏水性胆盐组成。在正常情况下,人体具有一套中和疏水性胆盐细胞毒性的自我保护机制,如磷脂可以与胆盐形成微胶粒(micelle)以降低其细胞毒性、胆汁所含的亲水性胆盐可以通过增强细胞膜的稳定性来对抗疏水性胆盐的细胞毒性等等。此外,胆汁主要成份的分泌完全依赖于位于肝细胞毛细胆管面的肝胆膜转运蛋白(HMTs),HMTs基因表达异常有可能导致胆汁淤积和胆管损伤。已经有研究提示肝移植术后早期存在胆汁成份失衡的现象。综合近年来国内外的研究结果,“毒性胆汁”假说在移植肝冷保存/再灌注胆管损伤中的作用日益受到重视。因此我们提出如下设想:如果我们能对胆汁的成分进行主动调控,增加胆汁中磷脂及亲水性胆盐的比重,是否有助于中和疏水性胆盐的细胞毒性、减轻移植肝胆管树损伤呢?。3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂(辛伐他汀)因其对血脂的主要成份有明确作用,并有良好的危险效益比,以及此类药物独特的降脂效益而应用日趋广泛。最近一些研究发现,他汀类药物对大鼠肝胆管磷脂的分泌有显著性影响,5天以上的长期治疗可诱导肝磷酸卵磷脂(PC)的合成和促进胆汁磷脂的排出,但对胆盐的分泌没有影响[3]。疏水性胆盐具有很强的细胞毒性,在胆管损伤中扮演着重要角色。主动改变胆汁的成份,防止胆盐对肝细胞及胆管上皮细胞的细胞毒性作用,有着重要的现实意义和临床应用价值。本研究拟以探索这一防治策略为主要目的,建立一种适用于移植肝胆道问题研究的大鼠肝移植模型,探讨经历CPRI后移植肝胆汁主要成份的变化规律及与胆管损伤的相关性,并对磷脂转运蛋白的表达及功能变化进行研究,为临床上移植肝胆道并发症的防治提供新的思路。二、方法为了验证我们的假想,本实验设计如下:首先,建立重建肝动脉的大鼠肝移植模型,设置辛伐他汀喂饲(实验组)、标准饲料喂养(对照组)和假手术组,实验组和对照组供体肝脏经历UW液12小时保存后植入受体,于术后14天获取大鼠肝脏、血液及胆汁标本;随后,应用高效液相色谱法(HPLC)检测胆汁标本中胆盐的成份及变化情况,并进一步分析胆汁和血清中磷脂(PL)和总胆汁酸(TBA)的变化情况,评价经过辛伐他汀处理后,移植肝大鼠的胆汁成份变化情况;然后,观察肝脏组织的病理学变化,并探讨这些变化与胆汁磷脂分泌之间的关系;最后,应用免疫组织化学和实时定量PCR的方法检测磷脂转运蛋白的表达变化,探讨辛伐他汀对大鼠移植肝磷脂变化的作用机制。三、结果1.动脉化的重建肝动脉的大鼠原位肝移植模型适合应用于胆道并发症的研究,具有较好的操作性和可重复性;2.经辛伐他汀处理后大鼠胆汁中磷脂成份明显增加,与假手术组和对照组相比具有统计学意义(P<0.05);对胆汁中胆盐成份没有影响,间接的降低了胆汁中胆盐/磷脂的比值,减轻了这一造成移植肝胆管损伤因素的作用;3.术后辛伐他汀处理组大鼠的血清胆系酶谱(r-GT、ALP)显著降低,有统计学意义(P<0.05);并且这一变化趋势与胆汁中磷脂的分泌呈负相关;4.肝脏组织HE、Masson染色发现,对照组肝脏组织炎症反应明显,胆管损毁严重,并伴有大量的胆管增生;而辛伐他汀处理组的病理学变化则较对照组轻微;5.免疫组织化学方法显示磷脂转运蛋白(Mdr2 P-糖蛋白)在大鼠肝细胞膜上的表达辛伐他汀处理组较对照组有明显增强,主要位于汇管区及门静脉周围区域;假手术组大鼠Mdr2 P-糖蛋白仅有微弱表达;6. Taqman探针法实时定量PCR检测Mdr2 mRNA的表达在辛伐他汀处理组大鼠中亦有显著增强,且具有统计学意义(P<0.05)。四、结论1.辛伐他汀能有效的增加大鼠移植术后胆汁中磷脂成份的分泌,而对胆汁中胆盐及胆汁酸成份没有影响,并能显著降低胆汁胆盐/磷脂比率;2.胆汁中磷脂成份的增加显著改善了移植肝脏的功能,减少了肝脏组织的病理改变,有效保护了移植肝胆管及肝脏组织;这一增加磷脂分泌的机制可能是通过Mdr2基因的调节来实现的。