放射性颌骨骨坏死(osteoradionecrosis of jaws,ORNJ)是一种严重的放疗后并发症,一旦发生,很难逆转,没有自愈倾向。ORNJ通常会在放射治疗后几周或三年内出现。ORNJ主要的临床体征为长期不愈合的粘膜溃疡及死骨外露,严重病例也可形成窦道以及病理性骨折,患者表现为剧烈疼痛、张口受限等。ORNJ临床危害性大,并缺乏有效的预防措施和治疗方法,一旦发生ORNJ,通常需要多次手术治疗,这会严重影响患者生活质量。造成ORNJ预防与治疗困难的主要原因是其发病机制至今仍未完全清楚。ORNJ的发病机制一直是国内外研究热点,以往的各种发病学说,如放射、创伤、感染理论学说(radiation,trauma,infection theory)与低氧—低细胞—低血管的三低学说(hypoxic-hypocellular-hypovascular theory)及其衍生出的治疗方法均被证实存在明显缺陷。近些年来,有学者提出了放射性纤维萎缩学说,认为ORNJ是一种放疗诱导的纤维化疾病,或称为放射性纤维化(radiation-induced fibrosis,RIF),并且临床试验也证实了采用抗纤维化药物治疗ORNJ可取得明显的疗效。随着临床试验的进一步深入,已有研究人员根据放射性纤维萎缩学说提出了不同的ORNJ诊断与分型方法。但此学说尚缺乏具体的实验依据支持,ORNJ的具体纤维化过程并未完全阐明。根据目前对纤维化疾病的研究成果,我们认为肌成纤维细胞(myofibroblast,MFB)是纤维化疾病的主要效应细胞,其过度增殖、过量合成胶原以及促进细胞外基质堆积是造成纤维化的主要原因,也是目前纤维化治疗的重要靶点。但mfb是否也在ornj的发生中起重要作用仍不明确,尚缺乏关于ornj纤维化机制的实验室研究。因此,本研究通过建立能够体现rif完整病程的ornj动物模型,观察在ornj不同阶段纤维化与骨破坏之间的关系,同时观察病变组织中mfb的表达、分布特点、分化调控及细胞来源,以期进一步阐明ornj的放射性纤维化发病机制,为ornj的实验室研究提供新的研究平台,并对ornj预防和治疗提供新的思路和指导。具体内容包括以下四个部分:一.ornj动物模型的建立及评估目的:依据ornj新的临床诊断标准,建立一种可模拟ornj不同临床分期的复合型动物模型。方法:健康sd雄性大鼠36只,随机分为6组:a1、b1、c1为实验组,a0、b0、c0组为对照组;根据生物学等效公式bed=nd[1+d/(α/β)],实验组采用电子直线加速器对大鼠左侧下颌区进行照射,7gy/次,1次/d,照射5d;照射后6w,处死a1、a0组大鼠,并拔除b1、b0、c1、c0组大鼠左侧下颌磨牙;照射12w、18w后,分别处死b1、b0组大鼠和c1、c0组大鼠并取下颌骨标本。对所有标本进行组织学观察和显微ct扫描与骨组织显微形态分析。结果:实验组照射区可见,a1组门齿生长障碍,b1组死骨暴露,c1组咬合错乱,化脓性感染与病理性骨折等症状,对照组无症状。组织学观察可见,实验组照射区骨髓腔与牙周膜内,炎性细胞浸润、纤维组织增生,b1、c1组还可见游离死骨;实验组门齿牙根与皮质骨渐进性破坏,c1组部分大鼠门齿牙根结构消失,周围皮质骨不连续;实验组空白骨陷窝增多,骨陷窝内骨细胞减少。显微ct结果显示:实验组相对骨体积(bv/tv)均低于对照组;实验组间bv/tv值相比,a1>b1>c1。结论:建立了一种能够模拟出轻度无症状(a1)、中度死骨暴露(b1)与重度联合症状(c1)三种不同ornj分型的复合型动物模型,为针对性研究ornj治疗方法提供了实验平台。二.mfb在ornj组织中表达特点的研究目的:观察mfb在sd大鼠照射区组织中的表达及分布特点,并观察组织中与mfb的转化和纤维化相关的上下游分子的表达情况。方法:对实验组与对照组的照射区组织标本进行mfb特异性分子标志物α-sma的免疫组织化学染色和和半定量分析,观察ornj中mfb的数量变化、组织定位并观察其随时间的变化情况;应用western-blot法对mfb相关的上下游分子tgf-β1、ctgf、colⅠ、colⅢ的表达水平进行检测。结果:mfb为α-sma表达阳性的梭形细胞,大量聚集在ornj动物模型的髓腔、死骨周围以及增生的牙周膜中;在ornj组织中,mfb、tgf-β1、ctgf、colⅠ、colⅢ的表达均明显高于对照组,α-sma阳性细胞数量和强度、ctgf、colⅠ、colⅢ的表达随时间的推移而增加,但tgf-β1的表达随时间的推移而下降。结论:同其他纤维化疾病一样,ornj中也同样存在着mfb的大量聚集,并且与mfb纤维化形成相关的上下游分子也呈高表达;mfb表达具有时间相关性,tgf-β1在mfb的早期转化中可能起到关键作用,而晚期可能主要由ctgf诱导其转化;提示mfb可能参与了ornj的发生过程,并具有重要作用,为ornj的纤维化理论提供了更多依据。三.mfb细胞的体外培养与观察目的:进行mfb的体外培养,以建立可进一步研究ornj纤维化机制的体外细胞学平台。方法:使用组织块法,取放疗区域的纤维化组织进行细胞培养,观察细胞形态、增殖情况,以成纤维细胞为对照,用免疫荧光染色方法观察特异性标记物α-sma的表达情况,使利用western-blot法观察α-sma、ctgf、colⅠ、colⅢ的表达水平;观察mfb在tgf-β1的作用下,α-sma、colⅠ、colⅢ表达水平的变化情况。结果:原代培养1w后,组织块周围开始爬出细胞,传代后7-10d可长满;传代细胞为梭形,且随着传代,细胞形态稳定;实验组细胞高表达α-sma,且ctgf、colⅠ、colⅢ的表达水平均高于对照组成纤维细胞;在tgf-β1作用下,实验组α-sma、colⅠ、colⅢ的表达水平增高。结论:从ornj组织中可成功分离培养mfb细胞,体外培养的mfb细胞具有分泌ctgf、colⅠ、colⅢ的作用,并且tgf-β1可促进其转化增殖和发挥纤维化作用,进一步说明mfb在ornj的纤维化过程中发挥重要作用。四.mfb体外诱导分化实验目的:研究下颌骨局部的骨髓间充质干细胞(bmscs)是否可以向mfb转化,验证病变局部是否存在mfb的细胞来源。方法:分离、培养bmscs,并对其进行鉴定,使用tgf-β1对其进行诱导,观察细胞增殖情况,以及α-sma、ctgf、colⅠ、colⅢ表达的变化情况。结果:经tgf-β1诱导后,细胞α-sma的表达量明显增高,且ctgf、colⅠ、colⅢ分泌量增多。结论:下颌骨局部的bmscs可以转化为mfb,局部的bmscs是ornj中mfb的来源之一,更进一步说明颌骨局部存在mfb转化的细胞基础。