水稻黑条矮缩病毒(Rice black streaked dwarf virus,RBSDV)是一种以灰飞虱为主要传播介体,在我国主要水稻种植区广泛流行的水稻病毒病。该病害常规方法难以有效防治,危害程度逐年加重,造成水稻的减产甚至绝产,给我国水稻生产造成了重大的经济损失。RNA介导病毒抗性是目前培育抗病毒转基因作物最有效、快捷的方法,转基因植株具有抗性强、抗病持久性强、生物安全性高等特点,具有重大应用价值。本研究以实验室转育获得的抗水稻黑条矮缩病转基因水稻KRBSDV为实验材料,以受体镇稻88为对照,对水稻的农艺性状、除草剂抗性、病毒抗性、种子营养成分等生物学特性进行了检测;进而对外源基因的整合、转基因水稻与野生型之间在RNA和蛋白水平表达差异等分子生物学特性进行了分析;同时,从食品安全角度对转基因水稻安全性进行了评估。主要的研究结果和结论如下:(1)转基因水稻的农艺性状、抗性及种营养成分分析农艺性状调查及抗性鉴定的结果显示,转基因水稻KRBSDV在生长各个时期,植株表型与镇稻88在形态上无明显差异,转基因水稻表现出良好的对PPT和RBSDV的抗性;种子营养成分析显示,转基因水稻种子中的水分、灰分、维生素含量、矿物质含量、蛋白质含量、植酸含量及胰蛋白酶抑制剂含量等与野生型水稻差异不显著。上述结果表明,转入的发夹RNA(hpRNA)结构的RBSDV-CPM基因能够有效地干扰RBSDV的侵染,同时转基因水稻的表型性状并未受到插入基因的明显影响。(2)Southern杂交表明,转基因植株中外源基因为单拷贝,且只有一个插入位点。利用hiTAIL-PCR技术测定了转基因插入位点两侧序列,最终确认插入位点为水稻二号染色体93244至94002bp区间,并伴随着24个核苷酸缺失的现象。该插入位点位于两个基因之间,这两个基因均为编码假定蛋白的基因。(3)提取分蘖期水稻叶片mRNA,利用RNA-seq进行测序分析。统计结果显示,KRBSDV与镇稻88叶片mRNA表达共有6869条具有显著差异(P<0.05);两者间表达显著差异mRNA表达分布在全部12对染色体上,插入位点附近及水稻二号染色体上的差异表达显著的m RNA数量,相对其他染色体并无明显增多。转基因水稻中,选择标记基因bar基因的相对表达量为10215,目的基因RBSDV-CPM基因的相对表达量为6531,在野生型水稻中未检测到bar基因和RBSDV-CPM基因的表达。分析表达差异显著的mRNA,发现其主要涉及转运、转录翻译调控、蛋白结合转录、结合蛋白、结构分子活性等多种不同种类的蛋白,如核糖体、ATP转运合成相关蛋白、伴侣蛋白、热敏蛋白、组蛋白等。(4)对KRBSDV转基因水稻和镇稻88种子蛋白质进行SWATH分析,共标记蛋白1887种,其中346个蛋白表现出显著差异,其中20s、40s、60s核糖体蛋白、ATP转运合成相关蛋白、几种伴侣蛋白、谷蛋白、组蛋白和几种病原菌诱导防御反应蛋白以及热敏蛋白含量与野生型间差异尤为显著。选择标记基因bar基因表达的PPT乙酰转移酶(Phosphinothricin N-acetyltransferase,PAT)在种子中能够检测出,但相对表达量不高;未检测到目的基因片段RBSDV-CPM的表达。对表达差异显著的蛋白进行整体分析,发现根据功能划分蛋白比例与测定到的整体功能蛋白比例接近。在NCBI检索显著差异蛋白序列,利用过敏原筛查数据库The allergen Online Database对序列进行筛查,未发现转基因水稻中产生新的致敏性蛋白和毒性蛋白。综合以上结果,转基因水稻中外源基因的表达赋予水稻对除草剂PPT抗性,显著地提高了水稻对RBSDV的抗性,但转基因植株的农艺性状及种子的营养成分与野生型水稻无显著差异;外源基因的插入虽引起部分水稻基因在RNA水平和蛋白水平的差异表达,但未发现毒性蛋白和新的过敏原蛋白的产生,表明转基因水稻具有良好的食品安全性。