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研究背景及目的慢性下腰痛在各类人群中都普遍存在[1]。现有的研究表明,椎间盘的退行性病变是慢性腰痛的主要病因[2,3],因此关于椎间盘退变的研究是脊柱外科基础研究的热点。椎间盘的退变与多种因素相关,包括压力,老化,炎症,营养途径等。随着退变的进展,椎间盘的组织学特点发生变化:纤维环组织出现细小裂隙甚至破损,髓核组织脱水,血管和神经组织渗透,破坏了原有的内环境稳态;软骨终板的钙化导致原有营养途径受阻[4];从功能和生理学的角度分析不难发现,这些组织学变化也促进了退变的进展。进一步的研究发现,随着退变的进展,髓核组织细胞外基质成分和细胞表型也发生改变。作为椎间盘的功能基础,基质成分的变化被认为是椎间盘退变的标志[5]。目前的研究发现:退变的椎间盘组织中,髓核基质中亲水性蛋白聚糖和II型胶原的减少,I型胶原和蛋白聚糖分解产物增加[6];与细胞外基质降解相关的炎症因子以及各类分解酶(比如IL-1β/TNF-α/MMP/ADAMT)表达上调[7,8]。近年来,与椎间盘特殊内环境、细胞生理功能相关的基因或者蛋白被越来越多的发现、研究和报道,它们有的可以作为椎间盘组织退变的标志,有的细胞的正常代谢或者退变的相关病理进展中发挥作用;这些研究成果可以帮助我们更深刻的认识椎间盘的退变,进而找到更好的诊疗方法。1-磷酸鞘氨醇(S1P)是一种重要的脂质介质,是鞘氨醇激酶(SPHK)的催化作用下鞘氨醇磷酸化生成的。它参与细胞迁移、分化、炎症反应以及血管生成等多种生物反应[9-11]。S1P通过与其受体结合发挥作用,目前已经确定的S1P受体(S1PR)有5种亚型,都属于G蛋白偶联型受体。值得注意的是,在人类软骨细胞中,S1P可以通过活化其受体抑制白介素1β(IL-1β)引发的基质降解作用,由此推断S1PR的活化可能成为骨关节炎的治疗作用靶点[12,13]。考虑到髓核细胞和软骨细胞相似的生物学特点,S1P及其受体在椎间盘的退变的治疗和控制中表现出一定的应用前景。但是,有关S1PR在椎间盘组织中的表达以及S1P在椎间盘退变中的作用尚未见文献报道。在本研究中,我们首先证实S1PR在髓核组织的表达;进而对比了不同退变的程度的髓核细胞中S1PR的表达水平,探讨S1PR与椎间盘退变中可能的相关性;在此基础上我们对其在椎间盘退变中的作用进行了初步探索。材料方法1.标本的收集。本研究已获得新桥医院伦理审查委员会批准并与患者签署书面知情同意文件。纳入标准实验组:椎间盘退行性疾病(包括腰椎间盘突出、腰椎管狭窄或者腰椎滑脱)的患者;对照组:青少年椎体骨折的患者,无椎间盘退变影像学表现得腰椎骨折患者的椎间盘标本。排除标准:并发感染、肿瘤、免疫性疾病或者其他全身性疾病的病例。手术标本收集之后,分成两部分分别进行组织形态学实验(包括苏木素-伊红染色、藏红-固绿染色免疫组织化学)和细胞学实验(包括髓核细胞的分离培养、Real-time PCR和western-blot实验);根据已发表的文献的评价标准[14],从组织学角度对每一例椎间盘标本退变的程度进行评价和分级,并分析了组织分级与priffmann分级[15]的一致性。2.S1PR在不同退变程度的椎间盘中的表达差异通过免疫组织化学、免疫细胞化学的方法明确S1PR在椎间盘组织中的表达和定位。通过Real-time PCR和western blot评价对比不同程度退变程度的髓核细胞中S1PR的表达水平变化。3.S1PR在椎间盘退变中的作用分离培养的髓核细胞分为3组,即对照组、IL-1β处理组、IL-1β+S1P处理组;通过Real-time PCR和western blot对比3组髓核细胞中基质降解酶:MMP-3和ADAMTS4的表达水平;不同浓度的S1P分别作用于髓核细胞,通过ELISA和阿利新蓝染色对比处理前后髓核细胞中蛋白聚糖(aggrecan)的表达水平的变化。结果1.组织学评分可以有效的对椎间盘退变的程度进行评价,与影像学priffmann分级结果基本吻合。2.免疫组织化学证实:髓核组织中S1PR1/2/3都有表达,S1PR2的表达阳性率略高于S1PR1/3;免疫细胞化学实验证实:S1PR在髓核细胞中主要定位在细胞膜上和细胞质中。3.Real-time PCR和western blot实验对比不同程度退变的髓核细胞中S1PR的表达水平,发现在严重退变的髓核细胞中S1PR1/2/3的表达水平明显下降。4.IL-1β可以明显上调髓核细胞中MMP-3和ADAMTS4的表达水平:S1P可以抑制的IL-1β的效用使髓核细胞中这两种基因的表达降低;ELISA和阿利新蓝染色发现S1P处理后髓核细胞中AGG的含量下降。结论1.髓核组织可表达S1PR1/2/3,其中S1PR2的表达阳性率最高,并主要定位在细胞膜和细胞质2.严重退变的髓核细胞中S1PR1/2/3表达水平明显下降,表明S1PR的表达可能与髓核的退变相关3.在髓核细胞中S1P/S1PR可以抑制IL-1β引起的基质降解效应,S1P处理髓核细胞,下调了AGG的表达水平,这些结果说明S1PR及其相关信号在髓核退变中发挥了作用。