论文部分内容阅读
研究目的:1、探索结直肠侧向发育型肿瘤（laterally spreading tumor,LST）的DNA甲基化特征,尤其是对通常容易被忽略的基因组区域进行分析。2、探索LST和隆起型腺瘤（protruded-type adenoma,PA）之间主要的DNA甲基化差异。3、通过全基因组DNA甲基化分析来探讨LST在常见信号通路中的特异性表观遗传变异。研究方法:1、选取入组患者和采集样本2、甲基化450k芯片检测3、差异性甲基化位点（differentially methylated position,DMP）和差异性甲基化区域（differentially methylated region,DMR）的筛选使用配对t检验比较LST组与对照组β值的差异。应用Bonferroni校正后的q值<0.05,从每组配对比较中筛选LST相关的DMP。利用minfi软件包对DMP的潜在区域聚类进一步分析,确定所组成DMR。4、DMP的分布分析按所处的基因组区域、染色体位置对DMP进行分层,并在450k芯片中与各自分层相关的区域、位置进行比较。因样本量较小,我们使用Fisher’s独立精确检验来分析特定的基因组区域、染色体位置的DMP数量与预期值的差异是否存在统计学意义。然后再对超甲基化DMP与低甲基化DMP的数量比进行Fisher’s精确检验,以评估其是否在每个基因组区域、染色体位置中的分布差异都存在统计学意义。统计学检验水准设定为经Bonferroni校正的α=0.05。5、焦磷酸测序验证本实验在10组含正常黏膜对照的病例样本中进行研究,另外新增加了9组相同入组标准的病例样本以进行芯片检测结果验证。验证方法为焦磷酸测序。6、基因本体（Gene Ontology,GO）和通路富集分析7、组蛋白修饰富集分析8、公共数据的下载及标准化从NCBI基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus,GEO）下载经过处理的DNA甲基化数据GSE48684。另从GEO下载了一套11对LST和匹配的正常结直肠粘膜的DNA甲基化数据和表达分析数据GSE77635。使用RNA-seq TMM方法标准化处理,来量化转录因子和与IGR DMP和DMR相关的最近基因的表达水平。9、使用18态ChromHMM模型计算DMP和DMR的观察值和预期值18态的ChromHMM模型从依据hg19标准人类基因组数据的Roadmap表观基因组计划数据库中下载。使用自定义R代码来计算表观基因组n中状态m的DMP和DMR预期总数,然后将研究中观察到的表观基因组n中状态m的DMP和DMR总数,与预期总数进行比较（具体公式详见正文部分）。10、识别转录因子结合位点（transcription factor binding site,TFBS）的富集从hg19人类基因组数据集中获得了抑制区DMP的基因组序列,并将DMP、DMR和450k探针的检测区间扩展到1000bp。利用MEME套件中的FIMO工具,使用默认脊椎动物数据库进行富集的结合模体查找分析,设定其检验水准q值（经FDR校正的p值）为0.05,当目标序列与背景序列的比值>1.1,定义为转录因子结合模体的显著富集。11、辅助数据的可用性本研究相关数据已保存在NCBI的基因表达综合数据库中,登记号为GSE106556。研究结果:1、在LST中发现DMP与DMR并验证我们首先明确了LST的DNA甲基化异常特点。经严格分析并采用必要的统计学校正方法（Bonferroni校正P<0.05,图3A）计算分析,确定了10个LST样本中2452个DMP。同时多个染色体的DMP分布差异也具有显著的统计学意义,特别是chrX(P<3.37×10-18,Fisher’s精确检验)和chr 8(P<1.85×10-16,Fisher’s精确检验)。值得注意的是,我们发现了1925个低甲基化的DMP（78.51%）显著高于527个超甲基化的DMP（21.49%）（图3B）。然后,利用minfi软件包分析确定了DMR,明确了73个超甲基化DMR和13个低甲基化DMR。随后我们使用焦磷酸测序方法,在研究组及另外9组新病例样本中,验证了位于不同基因组区域的4个位点（P值较小,差异性较大的位点）的甲基化水平（图4）,结果发现所有4个位点在各样本中均显示出与450k芯片一致的差异性甲基化状态。2、DMP在IGR和TSS高度富集3、LST在TSS周围表现出显著的DNA甲基化异常4、IGR是LST的DNA甲基化水平异常的热区5、IGR的潜在功能研究发现“消化系统发育”是低甲基化的IGR-DMP调控的重要生物学功能,其中包括许多重要的发育转录因子,如TGFB2,FOXF1,FOXF2,GATA4,FGF10和FGF9（图8A）。研究同时发现,低甲基化的IGR-DMP与参与组蛋白去乙酰化的基因（HDAC2,HDAC4,HDAC9,NACC2,SALL1和SUDS3）（图8A）相关（组蛋白去乙酰化,-log10（P-值）=4.97）。该结果表明LST发生过程中DNA甲基化和组蛋白修饰之间存在相互作用的可能性。6、组蛋白H3K9me3在IGR-DMP高度富集7、正常粘膜的抑制区在LST中表现为去甲基化状态,LST中IGR-DMP的低甲基化可能导致转录因子功能失调8、LST、PA和CRC之间DMP与信号通路的富集状态通过Venn图显示了LST、PA和CRC三者共同重叠的DMP部分,其中有435个基因包含超甲基化DMP,而有517个基因包含低甲基化DMP（图13A）。然后,我们以信号通路为切入点,对不同类型肿瘤中的DMP进行了研究,发现与正常样本对照相比,CRC的超甲基化DMP中富集了PI3K-AKT通路,PA的超甲基化和低甲基化DMP均有PI3K-AKT通路富集,同时LST的低甲基化DMP也表现出PI3K-AKT的显著变化;然而在LST和PA之间,我们没有检测到任何共有的常见超甲基化DMP相关通路（图13B）。因此,DNA甲基化的区别在LST和PA之间可能非常明显。这一结果与临床预期的LST和PA之间导致肿瘤转化的分子机制不同是一致的。进一步研究我们发现在8条重要的表观遗传致病通路中,其DNA甲基化表达情况在LST和PA之间相反（图13C）。如MAGI2,PRKCB,FGF12,PDGFD,NGF,PIK3R5,GRIN2A和PDGFRA（图13D）等在Ras和Rap1信号通路所富集的基因在LST中是低甲基化表达而其在PA中却是高甲基化表达。这三种疾病也存在一些共同的表观遗传靶标基因,包括ECM、ITGA、CCDN1和GF（图15）。PI3K家族的IA因子、P21和FasL均表现出LST特异性的表观遗传学变化。相反,PA则表现出RTK-ERK通路的异常,可能导致细胞增殖、血管生成和DNA修复方面的问题。而蛋白质合成和肿瘤代谢异常是CRC的独特表现。研究结论:1、LST中的DMP在IGR和TSS高度富集,且低甲基化DMP和DMR主要位于IGR。2、LST中低甲基化的IGR-DMP通过影响抑制区的非结肠组织或细胞类型的调节元件,可能导致结肠细胞特异性表型的丧失,并可导致肿瘤组织的形成。3、PI3K-AKT、Ras和Rap1等信号通路所富集的DMP的DNA甲基化表达情况,在LST和PA之间有很大区别,可能是两者在肿瘤转化的分子机制上存在差异的原因之一。4、PI3K家族的IA因子、P21和FasL均表现出LST特异性的表观遗传学变化,而PA则表现出RTK-ERK通路的异常,蛋白质合成和肿瘤代谢异常是CRC的独特表现。5、PI3K-Akt信号通路在LST、PA和CRC发生发展中有独特的表观遗传差异,这对LST、PA和CRC患者都具有非常重要的临床意义,可能成为早期监测标志物、治疗靶点和预后判断的生物标志物。