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禽呼肠孤病毒(Avian reovirus, ARV)是重要的家禽病原体之一,主要感染鸡和火鸡,引起鸡病毒性关节炎、矮小综合征、呼吸障碍综合征、免疫抑制等,给全球养禽业造成巨大的经济损失。但目前关于ARV主要的研究方向是病原分离鉴定、基因组测序、检测方法建立等,而对其分子致病机制的研究报道并不多。为了从根本上有效防控ARV感染,促进全球养禽业的健康发展,开展禽呼肠孤病毒致病机制的研究刻不容缓。细胞因子因具有广泛的生物学活性,是机体免疫应答和炎症反应的重要介质。目前已证明细胞因子在结核病、AIV感染、鸡传染性法氏囊病毒感染、球虫感染等疾病的致病过程中占有重要作用,但细胞因子在ARV感染导致机体广泛炎症和免疫抑制中的致病机制尚不清楚。为探讨ARV感染对细胞因子IL-1β、IL-6、IL-17、IL-18、IFN-γ和TNF-α的mRNA转录时相的影响,本研究首先建立了鸡IL-1β、IL-6、IL-17、 IL-18、IFN-γ、TNF-α和GAPDH基因的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法,然后用禽呼肠孤病毒标准强毒株S1133分别感染鸡胚成纤维细胞(CEF)和7日龄SPF雏鸡,利用已建立的方法检测分析IL-1β、IL-6、IL-17、 IL-18、IFN-γ、TNF-α在体外细胞和SPF鸡不同组织器官(关节、心脏、脾脏、胸腺、法氏囊和外周血白细胞)中不同时间的mRNA表达水平。并利用流式细胞术检测ARV感染SPF鸡外周血淋巴细胞CD4+和CD8+T细胞量的变化。根据GenBank上公布的鸡IL-1β、IL-6、IL-17、IL-18、IFN-γ和TNF-α和GAPDH基因序列,设计合成特异性引物,再以鸡胚成纤维细胞cDNA为模版构建的重组质粒作为标准品,然后构建SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR标准曲线,并进行熔解曲线分析。结果显示各基因的溶解曲线均呈单一溶解峰,扩增效率在95.6%-102.0%之间,线性相关性R2均>0.99,且各基因检测下限均为102拷贝数,组内变异系数均小于2.0%。说明本研究建立的检测方法特异性好,敏感性佳,重复性好。运用已建立的荧光定量PCR技术,检测分析ARV标准强毒株S1133感染鸡胚成纤维细胞后,ARV结构蛋白6C和IL-1β、IL-6、IL-17、IL-18、 IFN-γ和TNF-α的]mRNA动态转录水平。结果表明,ARV-S1133感染CEF10h后病毒结构蛋白σC mRNA的相对表达量开始迅速上升,在48h达到最高峰(13162.73倍,P<0.01); ARV-S1133感染后引起CEF中的IL-1β、IL-6、1L-17、IL-18、IFN-γ和TNF-a mRNA表达量发生变化。IL-1β、IL-6、IL-17、 IFN-γ和TNF-α基因的nRNA相对表达量在感染36h、48h、60h显著上调(P<0.05),且在48h达到峰值,表达量分别是88.78、40.43、97.19、111.58和4.4倍；IL-18mRNA转录水平在整个感染过程中表达量较低,在感染中后期,其表达量呈下调趋势；用ARV病毒5个不同接种剂量(105、104、103、102、101个TCID50)的感染CEF24h后,6个细胞因子的表达量与病毒的接种剂量线性相关,其中IL-1β、IL-6、IL-17和IFN-γ表达水平与病毒接种剂量正相关,IL-18和TNF-α mRNA表达水平与病毒接种剂量负相关。结果表明L-1β、IL-6、IL-17、IL-18、IFN-γ和TNF-a与ARV的病毒复制和致病过程相关。运用已建立的荧光定量PCR技术,检测分析ARV S1133株经足垫注射感染7日龄SPF鸡后,不同组织器官(关节、心脏、脾脏、胸腺、法氏囊和外周血)中IL-1β、IL-6、IL-17、IL-18、IFN-γ、TNF-α的相对表达动态。结果表明ARV感染可引起上述细胞因子mRNA转录水平发生变化,但各细胞因子在不同组织中变化情况不尽相同,提示上述细胞因子可能参与了ARV感染后不同组织器官的损伤过程。其中IL-1β、IL-6、IL-17、IFN-γ、 TNF-a在关节中表达量呈上调趋势,说明它们与ARV感染的关节病变相关。心脏中IL-18在感染14d和28d分别显著上调16.29倍和26.15倍(P<0.01),提示IL-18可能与ARV感染所致的心脏损伤相关。IL-1β、IL-6、IL-17、 IL-18、IFN-γ、TNF-α在不同免疫器官中均有不同程度的上调,表明它们可能与ARV引起的免疫抑制有关。本研究利用流式细胞术测定SPF鸡在ARV感染过程中,鸡外周血淋巴细胞CD4+和CD8+T细胞含量的变化。结果表明,SPF鸡感染ARV后7d和14d CD4+CD8+T细胞量高于对照组,其中CD8+T细胞量与对照组相比差异显著(P<0.05),提示CD4+和CD8+T细胞可能参与机体抵抗ARV的感染过程；感染后1d感染组CD4+、CD8+T细胞量显著低于对照组(P<0.05)；感染21d后,CD4+和CD8+T细胞量下降,提示ARV感染可能抑制了T细胞功能。本研究获得了禽呼肠孤病毒感染的体外细胞和SPF鸡组织器官中细胞因子IL-1β、IL-6、IL-17、IL-18、IFN-γ、TNF-α基因的mRNA表达动态的信息研究资料及SPF鸡外周血T细胞亚型变化资料,从分子水平上分析了不同细胞因子在ARV感染导致鸡胚成纤维细胞和SPF鸡组织器官炎症反应、组织损伤过程中的作用,并从外周血T细胞亚型变化上分析了机体对ARV的免疫反应,为进一步揭示禽呼肠孤病毒的分子致病机制及开展更深入的研究奠定了基础。