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第一部分滑膜成纤维细胞的分离培养与鉴定目的：应用组织块法分离、培养大鼠颞下颌关节滑膜成纤维细胞(SFs),建立其体外培养体系。方法：无菌条件下取大鼠颞下颌关节滑膜组织,对滑膜细胞应用组织块法进行原代培养,在倒置显微镜下观察其细胞形态,对第三代滑膜细胞进行免疫荧光染色进行表面标记物的鉴定,以确定该细胞为滑膜成纤维细胞(SFs)。结果：倒置显微镜下观察可见细胞传至第3代时,细胞形态基本一致,呈梭形,胞浆丰富,核卵圆,位于细胞中央,核仁清晰。取第三代滑膜细胞进行免疫荧光染色,可以观察到所有的滑膜细胞均对波形蛋白(vimentin)表达阳性,然而细胞对CD68蛋白呈阴性表达,阳性染色部位在胞浆内,CD68染色仅观察到蓝染的细胞核,说明此细胞来源于中胚层,并且具有成纤维细胞的特征,是滑膜成纤维细胞。结论：1.应用组织块法培养出的颞下颌关节滑膜成纤维细胞具有纯度高及稳定的特点；2.传至第3代时滑膜细胞分布均匀、形态一致,可以用来进行后续实验。第二部分PI3K/Akt信号通路对TNF-α诱导滑膜成纤维细胞分泌IL-1β、COX2影响的实验研究目的：探讨PI3K/Akt信号传导通路在TNF-α诱导的颞下颌关节滑炎中的作用,并探讨其分子机制。方法：实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术检测SFs IL-1β、 COX2 mRNA的表达；ELISA检测各组培养上清液中IL-1β、COX2蛋白的表达；免疫组织化学检测各组SFs中PI3K、P-PI3K、Akt、P-Akt的表达。结果：RT-PCR结果表明,与TNF-α组相比较,各组IL-1β、COX2 mRNA的表达量均有统计学差异(P<0.05)；而LY294002组与空白对照组相比IL-1β、COX2 mRNA的表达量无统计学差异；LY294002+TNF-α组与空白对照组相比,IL-1β、COX2 mRNA的表达量也无统计学差异。ELISA结果显示,LY294002组细胞上清液中IL-1β、COX2的含量与空白对照组相比无统计学差异；LY294002+TNF-α组IL-1β、COX2的表达量与空白对照组相比也无统计学差异；与TNF-α组相比较,其他各组IL-1β和COX2的含量均有统计学差异(P<0.05)。免疫细胞化学染色结果表明,TNF-α组PI3K、Akt平均光密度值与其他三组相比无统计学差异；TNF-α组P-PI3K、P-Akt平均光密度值明显高于其他三组且有统计学差异(P<0.05)；LY294002+TNF-α组与空白对照组相比,P-PI3K、P-Akt的表达量均无统计学差异。结论：1.TNF-α诱导SFs后可使细胞中IL-1β及COX2 mRNA表达升高,上清液中IL-1β、 COX2含量也明显增多。TNF-α诱导SFs可作为建立颞下颌关节滑膜炎细胞模型的方法。2. TNF-α诱导SFs产生炎性因子11-1β、COX2过程中存在PI3K/Akt信号通路的激活,LY294002可以阻断这一效应。3. PI3K/Akt信号通路在TNF-α诱导的SFs分泌IL-1β、COX2中发挥着重要的调节作用,此通路可能与颞下颌关节滑膜炎的发生发展密切相关。