研究背景软组织扩张技术已成为修复大创面比较理想的成熟的技术,但是扩张周期长以及其对皮肤组织结构具有的不利的影响是该技术主要的缺点。对于如何提高扩张效率这一难题,学者们长期以来尝试了多种方法,但效果均很有限。脂肪源性干细胞(Adipose-derived Stem Cells, ADSCs)是从脂肪组织中提取的一种具有高度自我更新和多向分化潜能的多能干细胞。目前它已成为修复和重建组织和器官研究的热点。在整形外科领域,已有许多研究证实ADSCs在皮肤软组织修复重建中有着各种各样积极的作用。然而目前对于ADSCs对扩张皮瓣的影响还知之甚少。研究目的首先总结临床上软组织扩张技术的应用,在肯定其与其他修复重建技术相比所具有的不可比拟的优势的同时,指出该技术具有扩张效率低下的缺点；随后进行动物实验,对扩张的皮肤进行ADSCs注射以观察对扩张效率有何影响,同时对扩张的皮肤进行组织学研究以观察ADSCs对扩张皮肤的组织结构有何影响。此外,通过对ADSCs进行5-溴-2-脱氧尿苷(5-Bromo-2-Deoxyuridine, BrdU)示踪标记以初步研究其迁徙分布的变化。研究最终目的是为临床上提高扩张效率提供一种可能的途径。研究内容及方法研究共分为两部分,第一部分是临床病例的经验性总结,第二部分为动物实验。第一部分系统性回顾了从2000年至2013年临床上采用额部扩张皮瓣进行面颈部修复重建的患者。根据血供特点对额部扩张皮瓣进行分型,然后根据面颈部的美学分区统计这各类型的皮瓣的应用情况,包括扩张相关数据、术后效果及并发症。根据统计分析结果提出额部扩张皮瓣在面颈部不同区域修复重建的策略。第二部分1.实验分组：实验对象为五指山猪,共12头,分为3组：A组3头,用来比较单纯扩张和扩张+针刺对皮肤的影响；B组3头,用来比较扩张+针刺和扩张+针刺+PBS对皮肤的影响；C组6头,用来比较扩张+针刺+PBS和扩张+针刺+ADSCs对皮肤的影响。比较方法均采用组内左右两侧配对比较。每头猪的每侧背部各埋置2个200m1圆形扩张器,并在皮瓣的中央区域采用文刺的方法标记处1×1cm2作为研究目标皮瓣。2. ADSCs体外培养、检测和标记：对C组的猪身上所获得的基质血管成分(Stromal Vascular Fraction, SVF)在体外进行培养增殖,以获得纯化的ADSCs。采用诱导分化和特殊染色方法检测ADSCs成脂和成骨能力。细胞培养至第3代时进行BrdU标记,并分析BrdU标记对细胞活率及分化能力的影响。3.皮瓣的扩张：将BrdU标记后的ADSCs注射到C组猪的文刺皮瓣区域皮内,随后每周对所有组的扩张器进行1次注水扩张,每次注水量为30ml,扩张时间为12周。4.扩张效率的检测：在扩张结束后,采用3D扫描仪记录每组文刺区域皮瓣表面积的大小,从而计算出表面积增加的数值并进行每组组内比较。5.皮肤组织学检测：在HE染色下观察表皮与真皮厚度的变化；采用增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen, PCNA)免疫组化染色观察表皮内增殖细胞数量变化的情况；使用天狼星红染色和Verhoeff铁苏木素染色分别对胶原纤维和弹力纤维染色并观察；采用a平滑肌动蛋白(α-Smooth Muscle Actin, α-SMA)免疫组化染色观察皮肤内血管密度的变化；使用扫描电镜和透射电镜观察皮肤超微结构的变化；最后使用BrdU免疫荧光染色对ADSCs进行示踪。研究结果第一部分根据额部不同血管特点可将额部扩张皮瓣分为4种类型。I型皮瓣为局部扩张皮瓣,主要可用于修复睑裂以上的缺损(病变),包括额部、上睑区,内眦区和外眦区。II型为以滑车上血管为蒂的皮瓣,Ⅳ型为以单侧颞浅血管为蒂的皮瓣,二者均可被用来修复面中部的缺损(病变)。II型皮瓣可用于鼻区不同区域的缺损(病变)的修复,而Ⅳ型皮瓣虽然也可用于修复部分鼻缺损,但用来进行全鼻或近全鼻再造较困难。II型皮瓣一般不能转移至颊部下部分,而Ⅳ型皮瓣可以。III型皮瓣为以双侧颞浅血管为蒂的皮瓣,可用于修复下三分之二面部及上颈部的大的缺损(病变)。扩张周期较长(2至8个月)仍为组织扩张主要的缺点之一,对此仍没有很好的解决方案。第二部分1.C组内的6头猪的ADSCs在成脂和成骨分化能力上无显著差别。BrdU的标记对ADSCs的分化能力亦无显著影响。此外,BrdU标记对ADSCs的活细胞率也无明显影响。2.A组和C组内各有1头猪的一侧背部的1个扩张器发生破裂；B组内有1头猪的一侧背部的1个扩张皮瓣发生局部坏死导致扩张器外漏,同样情况发生在C组的2头猪的身上(各1个扩张器)。排除发生并发症的扩张皮瓣后,A、B和C组可用于实验研究的皮瓣各有5对、5对和9对。3.A组所有猪的左侧背部扩张器扩张容量为352.20±2.59ml,右侧为355.20±3.03ml；B组左侧扩张容量为353.00±4.53ml,右侧为353.20±4.15ml；C组左侧扩张容量为354.22±2.91ml,右侧为355.44±1.74ml。t检验示均无统计学差异。4.扩张结束后,A组内左侧背部文刺区域面积增加0.644±0.068cm2,右侧变为0.662±0.067cm2；B组左侧增加0.642±0.079cm2,右侧增加0.650±0.070cm2；C组左侧增加0.632±0.083cm2,右侧增加0.908±0.131cm2。A组和B组左右两侧皮瓣扩张后增加的面积均无显著差异,而C组右侧皮瓣扩张后面积的扩大程度较左侧有显著增加(p<0.05)。5.A组和B组内左右侧扩张皮瓣表皮厚度无显著差异,真皮厚度也无显著统计学差异。而C组内右侧表皮厚度和真皮厚度均较左侧有所增加,但未达到统计学意义。6.对扩张皮瓣表皮层内PCNA+细胞计数结果显示：A组和B组内左右侧阳性细胞数量无显著统计学差异,而C组内右侧皮瓣表皮内PCNA+细胞数量较左侧有显著增加(p<0.05)。7.对扩张皮瓣内胶原的天狼星红染色的红色像素值分析结果显示：A组、B组和C组内左右数值对比无显著统计学差异,然而C组内右侧皮瓣内胶原染色的红色像素较左侧确有增高。8.A组和B组内左右侧皮内弹力纤维含量及分布无明显差别,且均呈紊乱不连续状排列,而C组内经ADSCs注射后的右侧扩张皮瓣内的弹力纤维含量较左侧有所增加,虽然纤维整体连续性较差,但仍然可见较多长片段的弹力纤维与皮肤呈平行分布。9.A组和B组内左右侧α-SMA+血管密度比较无显著差异,但C组右侧扩张皮瓣内的血管密度较左侧有显著的增多(p<0.05)。10.扫描电镜下,A组和B组内左右侧胶原纤维束直径及分布无明显区别,而C组内右侧皮内胶原纤维束较左侧的更细,排列得更紧密；透射电镜下,A组和B组内左右侧胶原纤维束内的细丝分布密度相近,而C组右侧皮内的胶原细丝分布更为致密,尚可找到功能较活跃的成纤维细胞。11. ADSCs示踪结果显示在注射体内后的第2周扩张皮瓣内仍有BrdU阳性的细胞,这些细胞大部分分布在真皮层,但有少量阳性细胞分布在表皮层。到第4周时,皮肤内已不能找到BrdU阳性细胞。研究结论第一部分额部4种扩张皮瓣类型均可被用于修复面颈部不同区域的缺损(病变),根据缺损(病变)的部位及大小,可以灵活地制定皮瓣的选择策略；扩张周期较长仍然是组织扩张技术的一大缺点。第二部分皮瓣内注射ADSCs可以显著增加皮瓣的扩张效率,ADSCs可以通过直接(多功能分化)和间接作用(旁分泌)促进细胞增殖、血管新生和细胞外基质生成。表皮内增殖的细胞数量增多,真皮内成纤维细胞增多及功能增强,从而造成表皮和真皮厚度有所增厚、真皮内胶原和弹力纤维含量增多。此外,ADSCs也可能通过某些未的知机制改变胶原纤维在张力下的顺应性,从而有利于皮瓣的扩张。