论文部分内容阅读
研究目的:探索富含半胱氨酸61编码蛋白（CCN1）对多发性骨髓瘤（Multiple Myeloma,MM）患者来源的成骨细胞（Osteoblasts,OBs）的作用机制以及Axl在MM细胞中的表达水平及其在MM发生发展中的作用。内容:（1）采用原代细胞培养、体外细胞模型增强或抑制CCN1表达等实验方法,观察CCN1对MM患者来源OBs的作用,并验证CCN1通过PI3K/Akt信号通路调控成骨细胞增殖分化的分子机制。以期明确CCN1在骨髓瘤骨病（Multiple myeloma bone disease,MBD）骨损害中的保护作用及其相关作用机制,并初步探讨相同浓度CCN1是否影响MM细胞增殖,为探寻新的治疗靶点提供实验依据。（2）检测不同人MM细胞系中Axl的表达水平、化疗药物作用后MM细胞Axl表达水平的改变;观察单药使用马法兰（Melphalan,Mel）以及联合Axl抑制剂R428作用后MM细胞系凋亡增殖的变化,以探索Axl抑制剂对MM的作用效果,为临床治疗MM提供实验依据。检测5T33MM小鼠骨髓中巨噬细胞M1、M2以及TAM细胞中Axl表达水平,观察R428对巨噬细胞,MDSCs及MM瘤细胞增殖凋亡的影响;检测MM患者血清中Axl表达量,与健康对照者比较。方法:第一部分CCN1对MM患者来源OBs的作用机制研究1.体外诱导MM患者来源的OBs,观察CCN1对OBs的作用和影响。2.使用AKT信号通路抗体试剂盒检测MM患者来源的OBs和健康对照组的OBs,筛选出CCN1作用于OBs可能的信号通路。3.Western Blot初步验证筛选出的CCN1作用OBs的相关信号通路后,寻找出相关信号通路上的关键位点,加入相应抑制剂或激动剂对照,再次应用Western Blot验证CCN1对MM患者来源OBs的信号通路。4.观察CCN1单独及联合不同浓度硼替佐米（Bortezomib,Bz）在不同作用时间点对MM细胞系的影响,CCK8检测增殖速率,流式细胞术检测凋亡率。第二部分AXL在MM中的作用初步探索1.定量反转录聚合酶连锁反应（Quantitative Real Time-PCR,qRT-PCR）检测人MM细胞系JJN3、U266中Axl的表达水平,qRT-PCR检测JJN3在不同浓度马法兰及硼替佐米作用24h后Axl的表达水平;免疫荧光技术（Immunofluorescence,IF）检测不同浓度马法兰作用24h后两种细胞系中Axl的表达,观察在化疗药物作用前后MM细胞中Axl的表达情况。2.Cell Titer-Glo检测不同浓度马法兰单独及联合Axl抑制剂R428作用24h后MM细胞系的细胞活性水平、流式细胞术检测凋亡水平,探索Axl抑制剂R428与传统化疗药物联合使用对MM细胞生存状态的影响。3.免疫荧光技术检测5T33MM小鼠骨髓来源的不同类型细胞中Axl的表达情况,Cell Titer-Glo检测不同浓度Axl抑制剂R428作用24h后5T33MM小鼠骨髓来源的抑制性细胞（Myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）及MM细胞的活性水平。4.ELISA法检测MM患者和健康对照血清中Axl的表达水平,观察Axl在MM患者与健康对照组表达水平的差异。结果:第一部分CCN1对MM患者来源的OBs的作用机制研究1.体外诱导MM患者来源的OBs,CCN1组中OBs数量高于PBS对照组中OBs数量（p=0.041）;说明CCN1具有促进MM患者来源的OBs增殖分化的作用。2.健康对照PBS对照组和CCN1组之间所有信号蛋白测试点的表达强度相同。而MM患者中糖原合成酶激酶-3β（Glycogen synthase kinase-3β,GSK3β）、磷酸酶和张力蛋白同源物（Phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten,PTEN）、真核翻译起始因子4E结合蛋白1（e IF4E-binding protein1,4E-BP1）、细胞外调节蛋白激酶（Extracellular Signal-egulated Kinase1/2,Erk1/2）的表达强度在两组之间存在明显差异。提示磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）/蛋白激酶B（Protein Kinase B,AKT/PKB）/GSK3β信号通路可能为CCN1作用MM患者来源的OBs的相关信号通路,而同浓度下CCN1（30ng/ml）对于健康对照者OBs并无明显促进增殖作用。3.与PBS对照组相比,CCN1组OBs中的PTEN表达水平较低（p=0.031）,细胞周期蛋白D1（cyclin D1）的表达水平较高（p=0.039）,p-AKT/AKT的比值较高（p=0.002）。与CCN1组相比,GSK3β抑制剂TWS119组的PTEN表达水平较高（p=0.001）,而p-AKT/AKT的比值较低（p=0.025）。通路下游蛋白cyclin D1在TWS119组和CCN1组中的表达水平相比对照组均有明显增加。CCN1对MM患者来源的OBs内的GSK3β具有明显抑制作用,CCN1可以通过PTEN-AKT-GSK3β信号通路刺激MM患者来源的OBs增殖分化。5.CCN1在30ng/ml浓度下单药使用和联合硼替佐米时均对人MM细胞系未见明显抑制作用。第二部分AXL在MM中作用的初步探索1.JJN3、U266中因Axl的表达水平过低无法被检测到,但经MM化疗药物作用后各细胞系中Axl的表达水平明显升高。马法兰作用24h后,JJN3中Axl相对表达水平较对照组有上升趋势,但并未达到统计学差异。硼替佐米作用24h后,JJN3中Axl相对表达水平相比对照组明显上升,除低浓度组0.625n M外,其余各浓度组1.25n M（p=0.023）、2.5n M（p=0.029）、5n M（p=0.015）、10n M（p=0.001）均达到统计学差异;且随着硼替佐米浓度升高,Axl表达水平呈现上升趋势。在高浓度马法兰组（Mel 5μM）作用24h后U266和JJN3均显示出较为明显的Axl表达,在较低浓度的马法兰组则未显示出明显的Axl表达。2.JJN3与U266在马法兰组的相对活性明显高于马法兰+Axl抑制剂R428（1μM）组的相对活性（Mel 0.625μM组p=0.025、1.25μM组p=0.021、2.5μM组p=0.025）。同时JJN3和U266在马法兰组的凋亡率分明显低于在马法兰+Axl抑制剂R428（1μM）组的凋亡率（Mel 0.625μM组p=0.001、1.25μM组p=0.003）。马法兰与R428联合使用时能显著提高其促MM细胞凋亡的能力。3.5T33MM小鼠骨髓中不同类型细胞中的巨噬细胞M1、M2以及TAM细胞中Axl表达较为明显,而5T33vv细胞（CD11b-）未见明显表达。R428对MM小鼠来源的MDSCs细胞及MM细胞均存在一定程度抑制作用,且R428对MDSCs的抑制作用要强于其对MM细胞的抑制作用,这一差异在R428 0.5μM浓度时最为明显。4.MM患者组中Axl表达量500.31±111.47pg/ml明显低于健康对照组中Axl表达量643.38±84.35pg/ml（p=0.001）,MM患者血清中Axl表达水平低于健康对照组。结论:1、CCN1对MM患者来源的OBs有刺激生长、促进分化的作用。2、CCN1通过增强PI3K/AKT/GSK3β信号通路刺激MM患者来源的OBs分化增殖,其对GSK3β的抑制作用与GSK3β抑制剂TWS119相类似。CCN1在同浓度（30ng/ml）下单药使用以及与硼替佐米联用均对人MM细胞系未见明显抑制作用。3、未在人MM细胞系JJN3、U266中检测到Axl的表达,但MM化疗药物作用后细胞系中Axl的表达水平明显升高。Axl特异性抑制剂R428与马法兰联合使用时可增强其诱导MM细胞凋亡的作用。4、5T33MM小鼠骨髓中M1、M2以及TAM细胞中Axl表达较明显,R428对鼠MM细胞和MDSCs均具有一定抑制作用,且R428对MDSCs的抑制作用要强于其对MM细胞的抑制作用。5、MM患者血清中Axl表达水平低于健康对照组,推测Axl在MM细胞的增殖中起重要作用。