苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）是目前世界上用途最广、产量最大的微生物杀虫剂,在世界范围内得到广泛的应用。编码Bt杀虫蛋白的基因也作为最主要的杀虫基因转入到了多种重要的粮棉作物中,在害虫防治中起着巨大的作用。但目前转基因Bt农作物和Bt制剂的使用正面临着致命的威胁,即害虫对Bt的抗药性。Bt毒素合理、有效的应用引起了全世界的关注和讨论。蛋白转导结构域（PTD-Protein Transduction Domain）是一类能自动穿透细胞膜,并能作为载体将其它生物大分子携带进入细胞膜内的一段富含精氨酸的多肽。近年来PTD在医学上的应用研究得到了空前的发展,其转导特性已成功地应用于多种疾病的临床治疗研究。 本研究通过PTD与Bt杀虫蛋白Cry1Ac融合表达载体的构建、融合蛋白的表达纯化、生物活性测定和免疫检测,证明了PTD增强了Bt杀虫蛋白Cry1Ac的杀虫活性。主要结果如下: 1.按照6His-TAT-Cry1Ac-6His和6His-Cry1Ac-6His的顺序,合成6个组氨酸、11个氨基酸TATPTD,成功设计构建了适合原核表达的四种PTD-Cry1Ac融合表达载体,即pET-1AC载体（含有pET-21b+Cry1Ac功能片段基因,简称P）、pET-T1AC载体（含有pET-21b+TAT肽+Cry1Ac功能片段基因,简称T）、pET-PQ1AC载体（含有pET-21b+部分Cry1Ac功能片段基因,简称PQ）、和pET-TQ1AC载体（含有pET-21b+TAT肽+部分Cry1Ac功能片段基因,简称TQ）。经测序分析,与实验设计完全一致,表明获得相应融合表达载体。 2.对构建的融合表达载体进行诱导、表达。在20℃,116rpm,振荡培养26h,IPTG浓度为0.1mol/ml条件下进行诱导,使表达的蛋白在上清大大多于沉淀,得到可溶性融合蛋白。这为纯化提供了极大的便利条件。 3.融合表达蛋白以小菜蛾室内种群和上海田间种群进行生物测定。生测实验结果如下:对小菜蛾室内种群,加TAT肽的融合蛋白pET-T1AC（T）的LC₅₀为60.20μg/ml,而pET-1AC（P）蛋白LC₅₀为80.82μg/ml,增效倍数为1.34倍;同样,加TAT肽的融合蛋白pET-TQ1AC（TQ）的LC₅₀为100.70μg/ml,而pET-PQ1AC（PQ）蛋白LC₅₀为116.67μg/ml,增效倍数为1.16倍。对小菜蛾上海田间种群,加TAT肽的融合蛋白pET-TQ1AC（TQ）的LC₅₀为20.51μg/ml,而pET-PQ1AC（PQ）蛋白LC₅₀为97.60μg/ml,增效倍数为4.76倍,表明PTD对Bt毒素Cry1Ac杀虫蛋白具有一定的增效作用。 4.四种融合蛋白进行纯化。纯化的蛋白与两个小菜蛾室内种群的BBMV（Brush Border Membrane Vesicles）进行ELISA免疫检测,结果表明:在BBMV中加入T和TQ蛋白分别比加入P和PQ蛋白的吸光值要大,说明T和TQ蛋白分别比P和PQ蛋白与小菜蛾BBMV结合性要强。同时也说明了PTD这种增强Cry1Ac杀虫活性的作用,可能与PTD增强了Bt毒素与昆虫BBMV的结合有关。该项目将PTD应用于农业研究领域,并证实了PTD对Bt微生物杀虫剂具有增效作