代谢工程改造大肠杆菌生产酪氨酸及芳香族衍生物

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芳香族化合物广泛应用于医药、化工和食品等领域,有着可观的市场规模。随着越来越严重的环境和资源问题,使用绿色、清洁可持续的生物技术生产芳香族化合物替代传统的化学合成或植物提取工艺变得越来越重要。酪氨酸作为一种芳香族氨基酸,不仅自身有着广泛的应用,而且以酪氨酸为前体,能够合成多种高附加值芳香族化合物。本研究以酪氨酸及重要芳香族衍生物为目标产物,利用代谢工程的手段改造大肠杆菌,从而构建生产酪氨酸及重要芳香族衍生物的细胞工厂。  在高产三脱氢莽草酸的细胞工厂基础上,调控影响酪氨酸合成的相关基因,构建生产酪氨酸的细胞工厂。通过强合成调控元件调控基因aroE,使大肠杆菌能够合成酪氨酸;通过组合调控竞争性途径的关键基因,trpE和pheA,减少了副产物的积累,提升了细胞工厂合成酪氨酸的能力;通过解除酪氨酸对分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶(TyrA)的反馈抑制,并过表达该基因,大幅度提升了酪氨酸的产量;通过尝试组合调控莽草酸途径的关键基因aroL、aroA和aroC,解除限速步骤酶的阻碍;最终通过摇瓶发酵酪氨酸产量达3.2g/L。通过优化发酵条件,在5L发酵罐中分批补料发酵酪氨酸产量达55g/L,与目前报道的最高产量相比,产量一致,发酵时间从48h较少到44h。  在生产酪氨酸的细胞工厂基础上,组合调控大肠杆菌内源基因和引入外源基因,构建多种芳香族衍生物的细胞工厂。在产酪氨酸的细胞工厂基础上,通过强合成调控元件调控编码4-羟基苯乙酸-3-羟化酶(HpaBC)的基因,构建了产左旋多巴的细胞工厂,分批补料发酵68h左旋多巴产量达32.5g/L,约是目前报道的最高产量的3.7倍;在产酪氨酸的细胞工厂基础上,通过整合来源于粘红酵母的基因RgTAL并过表达,构建了产对香豆酸的细胞工厂,通过摇瓶发酵对香豆酸产量达363mg/L;在产对香豆酸的细胞工厂基础上,通过强合成调控元件调控基因hpaBC,构建了产咖啡酸的细胞工厂,通过摇瓶发酵咖啡酸产量达106mg/L;在产酪氨酸的细胞工厂基础上,通过整合来源于酿酒酵母的基因ARO10并过表达,构建了产酪醇的细胞工厂,同时敲除基因feaB,使用弱合成调控元件调控tyB和aspC,逐渐提升了酪醇的生产能力,通过摇瓶发酵酪醇产量达1.75g/L,是目前微生物生产酪醇的最高产量;在产酪醇的细胞工厂基础上,通过强合成调控元件调控基因hpaBC,构建了产羟基酪醇的细胞工厂,通过摇瓶发酵羟基酪醇产量达513mg/L。  综上所述,本研究在基因组水平上,通过系统的调控合成目标芳香族化合物的基因,构建了多种大肠杆菌细胞工厂。这些细胞工厂遗传背景清晰,不含任何质粒,菌株性能稳定,发酵过程无需添加抗生素和诱导剂。发酵工艺简单,利用无机盐培养基发酵,以葡萄糖和氨水作为碳氮源,在生产上有着较大的优势,有着潜在的商业前景。本研究也表明了利用大肠杆菌生产芳香族化合物的巨大潜力,为生产一系列芳香族化合物奠定了基础,为传统的生产方法提供了新的途径,为绿色制造提供了借鉴。
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