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二酰基甘油酰基转移酶(Diacylglycerol Acyltrabsferase,DGAT)是控制甘油三酯合成的关键酶,分为两种亚型,编码这两种酶的基因分别是DGAT1和DGAT2。宗地花猪属于肉脂兼用型猪种,其脂肪沉积速率较快,皮脂率较高。本研究以宗地花猪为试验动物,针对DGAT1和DGAT2基因mRNA序列设计shRNA序列,构建RNA干扰表达载体,并体外分离培养原代肝细胞和肌内前体脂肪细胞,将DGAT1和DGAT2的shRNA干扰载体分别转染至肝细胞和肌内前体脂肪细胞中,采用RT-qPCR分别检测shRNA干扰载体对原代肝细胞和肌内前体脂肪细胞中DGAT1和DGAT2 mRNA表达的下调作用,研究DGAT1和DGAT2基因的功能以及其对脂肪沉积的影响作用,为宗地花猪选育过程中控制脂肪沉积提供一定的理论基础。主要研究结果如下:1.根据猪DGAT1和DGAT2基因的mRNA序列,分别设计3条shRNA序列和1条阴性对照序列,将shRNA转化为DNA双链序列后插入空载体pGPU6/GFP/Neo上,获得重组载体pGPU6/GFP/Neo-DGAT1-1、pGPU6/GFP/Neo-DGAT1-2、pGPU6/GFP/Neo-DGAT1-3、pGPU6/GFP/Neo-DGAT2-1、pGPU6/GFP/Neo-DGAT2-2、pGPU6/GFP/Neo-DGAT2-3和pGPU6/GFP/NeoNC。2.以3日龄宗地花猪为试验动物,分离其肝脏和背最长肌,利用Ⅳ胶原酶消化肝脏组织获得原代肝细胞;利用Ⅱ型胶原酶消化背最长肌,并结合差速贴壁法获得肌内前体脂肪细胞。分离出的肝细胞形态完整、密度大、活性高、贴壁良好,肌内前体脂肪细胞纯度较高,经IBMX、地塞米松、胰岛素诱导后可分化为成熟脂肪细胞,但其生长速度缓慢。3.将成功构建的pGPU6/GFP/Neo-DGAT1和pGPU6/GFP/Neo-DGAT2表达载体转染至猪的原代肝细胞和肌内前体脂肪细胞中,利用qRT-PCR进行干扰效率检测。结果表明,所构建的6个shRNA干扰载体均能抑制肝细胞和肌内前体脂肪细胞中目的基因的表达,肝细胞中DGAT1和DGAT2基因的抑制效率最高分别为78.45%和87.52%,肌内前体脂肪细胞中DGAT1和DGAT2基因的抑制效率最高分别为82.24%和89.82%。4.利用干扰效率最高的shRNA载体分别转染肝细胞和肌内前体脂肪细胞,测定转染前后细胞代谢液中甘油三酯和总胆固醇含量变化,结果表明,抑制DGAT1和DGAT2基因的表达,可降低肝细胞代谢液中甘油三酯和总胆固醇的含量。