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研究背景及目的肺癌目前是全世界发病率最高的恶性肿瘤,其中80%-85%为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。由于肺癌患者往往早期症状不明显,大部分患者初诊时已是晚期,失去手术机会。尽管靶向治疗和免疫治疗的不断发展为晚期NSCLC肺癌患者预后带来了显著的改善,但亚洲人群中驱动基因阳性晚期NSCLC患者也仅占40-50%,绝大部分晚期肺癌患者因驱动基因阴性无法行靶向治疗。同样,由于2/3以上的晚期肺癌患者程序性死亡配体-1(Programmed death ligand 1,PD-L1)表达小于50%,导致大多数晚期肺癌一线免疫治疗仍需要联合化疗。因此,化疗在NSCLC一线治疗中仍占有重要的地位。既往临床研究及真实世界临床实践均发现,同样为驱动基因阴性晚期NSCLC患者在接受一线化疗时,疗效存在显著差异,因此探寻预测化疗疗效的生物标志物依然是当前肺癌研究领域的热点。随着二代基因测序(Next Generation Sequencing,NGS)技术的临床应用,近年来多项研究证实肿瘤突变负荷(Tumor Mutation Burden,TMB)与免疫治疗疗效呈显著正相关,TMB越高,免疫治疗疗效可能越好。除了在免疫治疗中应用之外,既往研究还证实TMB能够显著影响肺癌靶向治疗疗效,TMB还能够预测晚期结肠癌化疗疗效以及早期肺癌患者术后复发时间等。然而,TMB能否预测驱动基因阴性晚期NSCLC患者一线化疗疗效目前暂未见报道。因此,本研究拟通过探讨TMB与驱动基因阴性晚期NSCLC患者一线化疗疗效的相关性,为预测驱动基因阴性晚期NSCLC一线化疗疗效及预后判断提供新的标志物,同时也为TMB在晚期NSCLC患者临床应用提供新的视角。研究对象与方法1.资料采集本研究纳入2017年1月至2019年12月间就诊于上海长征医院肿瘤科的56例包含完整TMB数据的驱动基因阴性晚期NSCLC患者。本研究经过上海长征医院伦理委员会同意,鉴于研究性质属于回顾性研究,故患者无需签署知情同意书。收集所有患者以下临床信息:1)一般信息包括:性别、年龄、吸烟史、肿瘤家族史、初诊ECOG评分等;2)实验室检查指标包括:血常规、肝肾功能、C-反应蛋白(C-Reaction Protein,CRP)、D-二聚体、肿瘤标记物;3)肿瘤相关信息包括:原发灶部位、病理类型、TNM分期、有无脑转移、TMB、TP53或KRAS基因突变等;4)基于RECIST 1.1标准的疗效评估信息包括一线化疗无进展生存期(Progression Free Survival,PFS)、客观缓解率(Overall Response Rate,ORR)、疾病控制率(Disease Control Rate,DCR)等;5)预后信息包括:随访时间、生存状态、总生存期(Overall Survival,OS)等。所有研究对象均接受肿瘤组织NGS检测并计算出每个患者肿瘤组织TMB值,按TMB中位数将患者分为两组:低TMB组(TMB<中位数)、高TMB组(TMB≥中位数),分析TMB与患者临床特征间相关性,评估TMB以及TMB联合TP53/KRAS突变状态在驱动基因阴性晚期NSCLC患者一线化疗疗效及预后判断中的价值。在TMB预测晚期NSCLC患者免疫治疗疗效方面,由于目前缺乏统一的TMB Cut-off值,既往Checkmate-227研究设定TMB Cut-off值为10 mut/Mb,该Cut-off值亦为目前多数TMB相关研究的取值标准,故本研究亦采用Cut-off值为10 mut/Mb的标准分析TMB在疗效预测及预后判断中的应用价值。2、主要研究目标本研究主要分析TMB与驱动基因阴性晚期NSCLC患者一线化疗ORR、DCR、PFS、以及OS的相关性。3、数据统计方法计数资料以例数(百分比)表示,组间差异采用?~2检验,计量资料以X±S(均数±SEM)表示,在进行正态分布和方差齐检验的基础上使用独立样本T检验,非正态分布使用非参数秩和检验;相关性研究采用Spearman相关性分析法进行分析,中位生存时间采用Kaplan-meiter法进行计算,两组间生存差异显著性检验使用Log-rank法比较。单因素与多因素COX回归模型用于分析影响晚期NSCLC一线化疗PFS以及OS的因素。所有统计分析均在SPSS 23.0中进行,以P<0.05表示有统计学意义。研究结果1.一般临床资料特点及不同临床特点中TMB的分布情况在入组的56例患者中男性44例,女性12例,年龄在30至91岁之间,平均年龄62.23±12.86岁。采用非参数秩和检验分析TMB在不同性别、年龄、吸烟史、肿瘤家族史、ECOG评分、颅内转移、病理类型及TNM分期等因素下的分布情况,结果显示TMB在不同性别及ECOG评分中的分布有显著差异(P<0.05),男性患者TMB值高于女性,ECOG2分的患者TMB值高于ECOG1分的患者。2.影响TMB高低的临床特点及非驱动基因因素56例患者的中位TMB为7.14 mut/Mb,因TMB分布为非正态分布,故将中位数值定义为Cut-off值,将TMB<7.14的病例纳入低TMB组,TMB≥7.14的病例纳入高TMB组,其中低TMB患者27例,高TMB患者29例;采用?~2检验分析不同临床特点及非驱动基因因素与TMB值相关性,结果显示:高TMB组男性比例显著高于低TMB组(93.1%vs 63.00%),低TMB组TP53突变率高于高TMB组(66.67%vs 37.93%),差异均具有统计学意义(P<0.05)。采用spearman相关分析法对TMB值和TP53有无突变进行分析,结果显示两者表达呈显著负相关(spearman相关系数=-0.266,P<0.05)。3.TMB与驱动基因阴性晚期NSCLC患者一线化疗疗效的相关性本研究将7.14 mut/Mb和10 mut/Mb设定为Cut-off值,分别观察在不同Cut-off值标准下,低TMB组与高TMB组的驱动基因阴性晚期NSCLC患者接受一线化疗后的疗效及预后。以Cut-off值为7.14 mut/Mb分组,结果显示:低TMB组与高TMB组中ORR分别为22.22%与27.59%,差异无统计学意义(P>0.05);DCR分别为77.77%与58.62%,差异具有统计学意义(P<0.05)。中位无疾病进展期(Median Progression Free Survival,m PFS)分别为3.5月与2.3月,差异具有统计学意义(P<0.05)。亚组分型结果显示:在高龄(≥65岁)、无脑转移、KRAS野生型人群中低TMB组患者的m PFS均显著优于高TMB组患者(P<0.05)。运用COX单因素回归分析显示本研究人群中仅TMB与驱动基因阴性晚期NSCLC患者一线化疗疗效存在显著相关性(P<0.05)。以Cut-off值为10 mut/Mb分组分析TMB与晚期NSCLC患者一线化疗疗效的相关性,结果显示:低TMB组患者的ORR、DCR及m PFS均优于高TMB组患者(26.32%vs22.22%;73.68%vs 66.67%;3.3月vs 2.3月),但两组间差异均无统计学意义(P>0.05)。4.TMB与驱动基因阴性晚期NSCLC患者预后生存期的相关性本部分进一步分析了TMB与驱动基因阴性晚期NSCLC中位总生存时间(Median Overall Survival,m OS)的相关性,在56例晚期NSCLC患者中,31例达到死亡终点,25例未出现死亡或失访,整体人群m OS为11.0月(95%CI 8.3-17.5)。以Cut-off值为7.14 mut/Mb分组,低TMB组患者预后显著优于高TMB组患者(m OS:23.2月vs 8.1月,P<0.01)。亚组分析结果显示:在男性、无吸烟史、无肿瘤家族史、肺腺癌、TP53野生型及KRAS突变和野生型人群中均可见低TMB组患者m OS显著优于高TMB组(P<0.05)。进一步运用COX单因素回归分析显示性别、脑转移、TNM分期、ECOG评分及TMB与驱动基因阴性晚期NSCLC患者的预后密切相关,但COX多因素回归分析显示男性、脑转移是独立的预后不良因素(P<0.05)。同样,以Cut-off值为10 mut/Mb分组,低TMB组的预后也显著优于高TMB组(m OS:17.5月vs 7.8月,P<0.01)。5.探索TMB联合TP53或KRAS基因突变对于晚期驱动基因阴性NSCLC患者一线化疗疗效预测及预后作用的研究基于TP53、KRAS基因突变状态与TMB高低(Cut-off值为7.14mut/Mb),将所有患者分为四组(低TMB/TP53-WT(野生型),低TMB/TP53-MT(突变型),高TMB/TP53-WT,高TMB/TP53-MT;低TMB/KRAS-WT,低TMB/KRAS-MT,高TMB/KRAS-WT,高TMB/KRAS-MT),分别比较四组患者PFS与OS差异。在PFS方面,无论是TP53或KRAS,四组间m PFS均无明显统计学差异(P>0.05)。而OS方面,四组间存在显著差异,其中低TMB/TP53-WT组患者预后最佳,m OS为31.4月;高TMB/TP53-MT组患者预后最差,m OS为6.7月,差异具有统计学意义(P<0.05)。低TMB/KRAS-MT组患者预后最佳,m OS为31.4月;高TMB/KRAS-MT组患者预后最差,m OS为6.4月,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论1、驱动基因阴性晚期NSCLC患者接受一线化疗时,与高TMB患者相比,低TMB患者具有更高的DCR及更长的PFS;TMB能够预测驱动基因阴性晚期NSCLC患者一线化疗疗效。2、与高TMB患者相比,伴有低TMB的驱动基因阴性晚期NSCLC患者具有更长的OS,TMB能够用于判断驱动基因阴性晚期NSCLC患者的预后。3、不同TMB水平下TP53基因突变状态显著影响患者的预后,其中低TMB合并TP53野生型患者总生存时间最长,高TMB合并TP53突变患者总生存时间最短。而不同TMB水平下KRAS基因突变状态并未显著影响患者的预后。