目的:肝脏移植是终末期肝病唯一有效的治疗手段。然而供体的短缺严重制约了肝移植手术的开展,大量等待肝脏移植的患者在等待过程中失去了治疗机会。为了解决供体的短缺,欧美移植中心重新关注并开始越来越多的利用心脏死亡供体(Donation after cardiac death,DCD)。然而与脑死亡供体(Donation after brain death,DBD)相比,DCD经历了热缺血损伤,更容易出现原发性移植物无功能(primary non-function,PNF)、早期移植物功能不良(poor early graft function,PEGF)以及缺血性胆道疾病等并发症。在我国,由于没有脑死亡标准的法律规定,DCD成为了我国器官捐献最主要的来源。因此,如何减轻肝脏的缺血再灌注损伤,同时对供肝的质量进行评估以决定是否使用,是目前肝脏移植研究中的重中之重。缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion?injury,IRI)是肝移植术后导致器官丢失的主要原因。IRI的机制包括:氧自由基爆发、细胞内钙超载、酸中毒、炎性细胞反应等,而其中氧自由基爆发被认为是启动因素,在缺血再灌注损伤中占有极其重要的作用。氧自由基过量产生机制包括:黄嘌呤氧化酶,炎性细胞和线粒体等。越来越多的文献报道线粒体呼吸链在缺血再灌注损伤中氧自由基过量产生的关键作用,但是线粒体中氧自由基的产生途径及作用机制尚有待深入研究。最新的一篇文章发现小鼠不同脏器在缺血期都有三羧酸循环中间产物琥珀酸盐的累积,而再灌注时累积的琥珀酸盐通过线粒体呼吸链反电子传递,生成大量线粒体氧自由基,导致缺血再灌注损伤。因此在肝脏的缺血再灌注损伤过程中,如果在缺血期减少琥珀酸盐的累积,是不是可以减轻再灌注损伤,从而起到保护肝脏的作用。同时,在缺血末期检测琥珀酸盐的累积量,是不是可以预测再灌注损伤的严重程度,这样有助于评估脏器功能,减少脏器的丢弃率或增加有效脏器的使用率。在缺血再灌注损伤中,有很多文献报道MAPK通路在心脏、脑、肾脏等脏器中发挥着重要的作用,而在肝脏中的报道虽然很多,但有争议。同时MAPK的三条经典途径JNK,ERK,P38在肝脏的缺血再灌注损伤中的作用也不尽相同。MAPK通路的上游刺激因素中氧自由基占有非常重要的作用。因此氧自由基在MAPK三条经典通路的作用如何,是怎么通过MAPK通路影响肝脏的缺血再灌注损伤,是值得研究和验证的。对于肝脏移植,尤其是DCD时代的中国肝脏移植,如何修复肝脏和评估肝脏的功能,是至关重要的。目前机械灌注是提高供肝保存和评估供肝质量的大势所趋,但机械灌注的保护机制,以及如何提高和评估供肝质量是需要大量的实验去探究和验证的。因此结合琥珀酸盐、氧自由基、MAPK通路、机械灌注,是否可以更好的去保护DCD供肝和评估供肝质量,是本研究的目的所在。研究方法:建立稳定的小动物和大动物肝移植模型:小动物采用SD大鼠磁环双套管肝移植模型;大动物采用巴马小型香猪DCD肝移植模型。通过检测大鼠和猪肝脏在缺血期的琥珀酸盐含量验证缺血期琥珀酸盐累积在大鼠和猪上都适用。采用大鼠肝移植模型,应用药物丙二醛二甲酯(DM)、琥珀酸二甲酯(DS)干预缺血期琥珀酸盐的含量,通过肝移植对照组、DM组、DS组、DM+DS组4个手术组(每组6对),探究不同干预组琥珀酸盐含量的区别,并进一步通过ROS、MDA、肝功酶学、HE染色等指标比较缺血再灌注损伤的程度,验证琥珀酸盐通过氧自由基产生导致一定程度的缺血再灌注损伤。另外,通过对肝移植组供肝缺血前、热缺血30min、冷保存2h、通血1h、通血24h等各个时间点测定MAPK蛋白的表达情况,发现和缺血再灌注密切相关的JNK通路。采用大鼠肝移植模型,应用药物琥珀酸二甲酯(DS),SP600125(JNK抑制剂)干预,通过肝移植对照组、DS组、SP600125组、SP600125+DS组4个手术组(每组6对),检测每组ROS、MDA、肝功酶学、HE染色、JNK通路蛋白表达、MPTP开放程度、TUNEL等指标,验证琥珀酸盐,氧自由基,JNK通路,线粒体通透性转换孔、细胞凋亡的效应路径。另外,通过对肝移植组线粒体Sab和p-JNK的免疫共沉淀,发现JNK通路直接作用于线粒体的证据。采用猪肝移植模型,结合低温机械灌注和SP600125,将前面实验发现的效应路径运用到大动物肝移植模型上。手术组分4组(每组6对),CS组(热缺血30min+冷保存4h)、CS+SP600125组(热缺血30min+冷保存4h+SP600125),HMP组(热缺血30min+冷保存2h+低温机械灌注2h),HMP+SP600125组(热缺血30min+冷保存2h+低温机械灌注2h+SP600125),通过检测每组ROS、MDA、血清学检查、p-JNK及凋亡蛋白表达、MPTP开放程度、TUNEL、生存率等指标,验证低温机械灌注和SP600125在大动物模型上的保护作用,判断是否可以转化为临床应用。结果:大鼠和猪的肝脏在热缺血期和小鼠一样,有琥珀酸盐的不断累积,而在冷保存期轻度下降后基本维持稳定。通过药物干预缺血期琥珀酸盐的含量,发现各组肝移植后ROS、MDA、肝功酶学、HE染色等指标和琥珀酸盐含量相关,缺血末期琥珀酸盐含量越多,ROS、MDA生成越多,反映缺血再灌注损伤严重程度的肝功酶学和HE染色结果越差。肝移植各个时间点的MAPK通路表达:缺血前、热缺血30min、冷保存2h时p-JNK、p-P38、p-ERK蛋白基本没有表达,仅有p-JNK蛋白在通血1h和24h均明显升高,p-P38仅在通血24h后有所升高,而p-ERK在通血后均基本没有表达。通过DS、SP600125干预的肝移植组间差异比较发现SP600125可抑制p-JNK蛋白的表达,可减轻缺血再灌注损伤,该作用并不受DS的影响。而DS和SP600125共同干预组,JNK通路的上游蛋白表达升高,而p-JNK表达仍受抑制,而移植后的损伤和单纯SP600125组相似。通过免疫共沉淀技术发现p-JNK蛋白和线粒体支架蛋白Sab直接作用,影响线粒体功能。在不同组别的猪肝移植中,低温机械灌注可以减少供肝琥珀酸盐的含量,同时在ROS、MDA、血清学检查、HE染色、TUNEL、生存率等方面结果都优于冷保存组。低温机械灌注合并SP600125组在通血后1h的p-JNK蛋白表达、MPTP的开放程度和细胞凋亡方面较单纯低温机械灌注组有优势,虽然在血清学检查,生存率等方面前者由于后者,但差别没有统计学差异。结论:大鼠和猪热缺血期琥珀酸盐不断累积,在冷保存期轻度下降后维持稳定。缺血末期琥珀酸盐的累积导致再灌注时大量氧自由基产生,造成缺血再灌注损伤,大部分氧自由基通过JNK通路影响线粒体通透性转换孔,进而导致细胞凋亡造成缺血再灌注损伤。低温机械灌注的保护机制之一是可以通过减少缺血末期琥珀酸盐含量,减轻缺血再灌注损伤。低温机械灌注联合应用SP600126可以更好的提高供肝质量,改善肝移植预后。