背景:休克是个古老的课题,自从17世纪开始人们就开始探讨休克的救治,在300多年的人类历程中,由于有效药物的出现和治疗策略的改进,失血性休克救治的疗效得到了极其明显的提高,患者生存率得到了很大提高,但是对于重度创伤导致失血性休克仍有着极高的死亡率,这主要原因还是因为仍然未完全了解其发病的病理及生理过程。失血性休克是临床一种最常见的休克(如肝、脾破裂,消化道大出血,异位妊娠破裂等),发病的病理学改变主要是病变处的有效血液灌流量减少,随后引起组织细胞的氧合不足,最终引起病变组织功能障碍,在临床上失血性休克病理生理基础是大循环容量减少,组织氧供的减少,代谢产物的积聚,继而诱导微循环的衰竭,这种微循环的变化并不会因为短时间内大循环的恢复而恢复,反而会出现与期待相反的病理生理变化。微循环长时间的不通畅必然给细胞和器官带来逐渐的改变,最终是引起功能的衰竭,机体的死亡,在阐述这个过程中提出了一些假说:比如氧代谢假说,促炎症因子假说,微循环障碍假说,随着研究手段的逐渐丰富及日益深入,这些假说逐步融合,大循环血供减少-微循环衰竭-氧代谢障碍-促炎因子释放过多-循环衰竭加重这些病理生理过程彼此独立且又是相互联系,这种联系并非单一线性联系而是网状联系,其中加重或缓解循环衰竭的节点是目前大多不为所知的。在重症休克治疗之后,即使患者的血容量及血压能够接近正常,但高血流阻力现象依然存在,此情况主要是由于白细胞粘附和堵塞在微血管内,而不是来自于血管及血容量本身。休克时,微静脉壁上粘附的白细胞数目较正常情况下提高16-20倍,这致使微静脉的血流阻力增加。增加的血流阻力和减少的驱动压力,使微静脉的血流量迅速减少而导致微循环低灌流现象的发生。白细胞黏附会进一步形成白细胞嵌塞并出现无复流现象(no-reflow)。所以在不可逆性休克时,寻找能够治疗白细胞嵌塞和无复流的方法就显得十分重要。重症休克患者经过输血、补液扩容、大剂量血管活性药物等抗休克治疗以后,血压仍然难以回升,这种现象称之为顽固性低血压。顽固性低血压的发生与小动脉平滑肌细胞(ASMCs)对内源性或外源性血管收缩剂的反应性下降有关。探讨重症失血性休克血管反应性下降的机制成为现今研究的热点之一。据现有相关文献报道,可能与氧自由基使内源性儿茶酚胺失活、肾上腺素能受体失敏、代谢产物蓄积和能量耗竭、细胞因子(NO、ET等)机制相关。随着现代分子生物学的进步,为分子生物技术治疗失血性休克提供了更多可能。本实验小组通过前期实验对失血性休克大鼠进行基因芯片技术筛查,找到了相关的AOC3基因发现其在失血性休克、复苏大鼠中的表达存在明显差异而引起了我们兴趣。AOC3基因所编码的是血管粘附蛋白-1(VAP-1)是由763个氨基酸组成的含铜胺氧化酶(CAOs),这种蛋白可以广泛存在于哺乳动物的脂肪细胞、平滑肌细胞、内皮细胞表面,同时作为一种胞外酶,通过血管内皮细胞表面可以进入血浆形成可溶性血管粘附蛋白-1(sVAP-1)。在血浆中,作为胺氧化酶催化芳香族和脂肪族的伯胺类物质转化为醛类产生H2O2与NH3。VAP-1同时具有这样的双重功能,先前的文献报道VAP-1主要与非特异性感染相关如慢性肝脏疾病、慢性肾脏疾病、感染性休克以及其他一些疾病,血清中的可溶性VAP-1都可见到明显的升高,在肝炎、腹膜炎、皮肤感染、菌血症、急性创伤模型中,抑制VAP-1功能可以通过防止白细胞迁移减轻感染。由于VAP-1介导白细胞迁移和粘附于血管内皮细胞的特性,它也在心脑血管疾病如缺血性脑卒中,糖尿病和肿瘤密切相关,因此VAP-1可能会成为一个重要的分子生物学工具,或许可以成为一个肿瘤预后的标志物或药物治疗的靶点。但是关于VAP-1与重症失血性休克却未见报道,我们实验小组期望在这方面有所突破,为治疗重症失血性休克提供一种新的而有效手段。目的:1、明确在缺氧条件下,在mRNA水平和蛋白水平,人源性肝血窦内皮细胞的AOC3基因以及其编码蛋白VAP-1的表达特征。2、明确在缺氧条件下,人肝血窦内皮细胞AOC3基因诱导白细胞黏附功能的变化。3、明确患者失血性休克-复苏过程中血液中VAP-1含量及SSAO酶活性的变化规律。方法:1、制备AOC3过表达腺病毒并将其转染至人肝血窦内皮细胞(Human Sinusoidal Endothelial Cells,HHSEC),在常氧和缺氧状态(5%CO2,95%N2)下培养24小时、通过RT-PCR、Western Blot等方法,分别对转染和非转染的细胞中AOC3基因及VAP-1的表达情况进行检测;2、通过内皮细胞-白细胞黏附试剂盒,分别检测常氧及缺氧条件下,正常与AOC3基因过表达腺病毒转染后;正常及加入含铜氨氧化酶抑制剂(2-溴乙胺)后人肝血窦内皮细胞与白细胞黏附情况。3、选取因由大血管破裂、肝脾等脏器破裂、消化道大出血、妇产科疾病大出血等原因引起的急性失血性疾病所导致的失血性休克患者20名,正常人20名,抽取休克过程中及复苏后血液标本,通过.ELISA法测定VAP-1表达规律及SSAO酶活性。结果:1、在缺氧条件下,人肝血窦内皮的AOC3基因在mRNA水平的表达量较常氧条件组有显著升高(P<0.001),且AOC3基因转染组的表达上调更加明显(P<0.001),VAP-1蛋白的变化同AOC3转录水平的变化正相关;2、缺氧组中VAP-1诱导白细胞黏附的功能较常氧组显著升高(P=0.027),VAP-1诱导的白细胞黏附功能可显著被2-溴乙胺抑制,其抑制程度在正常人肝血窦内皮细胞中和转AOC3的人肝血窦内皮细胞中无显著差异性(P<0.001);3、失血性休克患者复苏过程中,ELISA定量显示sVAP-1含量休克过程中显著高于复苏后及正常人,复苏后显著高于正常人,SSAO酶变化同sVAP-1变化规律一致。结论:1、上述结果表明,在缺氧条件下,在mRNA水平,AOC3基因被激活转录,在蛋白水平,其编码蛋白VAP-1相应地发生功能性表达。2、缺氧能诱导并增强白细胞的黏附功能,但这种诱导增高的白细胞黏附功能可被VAP-1/SSAO酶抑制剂显著抑制。3、体内实验证实患者失血性休克病程中血清VAP-1含量升高,酶活性显著增高,复苏可减轻这种增高。