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[研究背景]胃癌是我国最常见的恶性消化道肿瘤之一,其发病率和死亡率分别占我国恶性肿瘤的第2位和第3位。胃癌发生发展的生理学过程受多种因素调控,近年来最新研究发现,假基因(pseudogenes)广泛参与了细胞的生物学过程,假基因是一类与编码基因非常相似,但无法表达具有功能蛋白质的细胞内非编码基因。部分假基因可以转录非编码RNA,这些长度超过200nt的非编码RNA为长非编码 RNA(long noncoding RNAs,lncRNAs)的一类。LncRNAs 在肿瘤细胞中的异常表达与肿瘤的发生发展有着密切的联系,充当原癌基因或抑癌基因的角色。DUXAP8为假基因来源的lncRNA,目前DUXAP8在胃癌细胞中的生物学功能及潜在机制尚不明确。[研究目的]探讨DUXAP8在胃癌中的表达及其生物学功能,并研究其调控机制。[研究方法](1)通过GEO数据库中胃癌病例-对照芯片数据分析DUXAP8在胃癌中的表达量;利用荧光实时定量PCR(qRT-PCR)验证结果,并分析临床病理资料。(2)MTT、克隆形成实验、Edu实验检测DUXAP8对胃癌细胞增殖能力的影响;流式细胞术检测DUXAP8对细胞周期及凋亡的影响;Transwell实验检测DUXAP8对胃癌细胞侵袭转移能力的影响。(3)高通量测序检测DUXAP8的下游靶基因,并利用qRT-PCR法验证结果。(4)RNA免疫共沉淀(RIP)实验及染色质免疫共沉淀(ChIP)实验研究DUXAP8下游靶基因与PRC2的分子机制。(5)构建靶基因过表达质粒,探讨靶基因功能并进行拯救实验。(6)构建裸鼠移植瘤模型,探讨DUXAP8对胃癌细胞体内成瘤能力的影响。[研究结果](1)通过分析GEO数据库中两份胃癌病例-对照芯片数据发现,DUXAP8在胃癌组织中显著性高表达;同时利用qRT-PCR法对结果进行验证。(2)通过分析胃癌患者的临床病理资料,发现DUXAP8在TNM分级较高、已发生淋巴结转移的胃癌样本中呈显著性高表达,并且与患者的预后密切相关。(3)细胞功能学实验结果表明,在胃癌细胞系中敲低DUXAP8的表达可以抑制胃癌细胞增殖和转移能力,促进胃癌细胞凋亡。(4)转录组高通量测序技术检测敲低DUXAP8后转录组的变化。结果显示:敲低DUXAP8后有133条mRNA的表达水平发生上调,315条mRNA下调。结合测序及qRT-PCR法结果最终确定PLEKHO1为DUXAP8的下游靶基因。(5)RIP和ChIP实验证实,DUXAP8可以与多梳抑制复合物2(PRC2)结合进而调控下游靶基因PLEKHO1。(6)构建PLEKHO1过表达质粒,通过功能学实验发现PLEKHO1在胃癌中行使抑癌基因的作用;拯救实验结果提示,过表达PLEKHO1可以拯救DUXAP8对胃癌细胞的促进增殖作用。(7)通过构建裸鼠移植瘤模型证实干扰DUXAP8的表达可以抑制胃癌细胞的肿瘤形成能力。[研究结论]本项研究首次阐明DUXAP8通过与PRC2结合表观沉默PLEKHO1的表达,从而促进胃癌细胞的增殖与转移。该研究提示DUXAP8在胃癌细胞中发挥原癌基因的作用,可作为胃癌患者长期生存率的独立预测靶标,参与评判胃癌的诊断及预后。