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血流再灌注是治疗心肌缺血的首选策略,然而由此带来的再灌注损伤是造成心梗面积增加、心肌细胞丢失的重要原因。近年的研究发现,缺血预处理、缺血后处理等机械性调控措施对心肌缺血/再灌注(Ischemic/reperfusion,I/R)损伤具有保护作用,并且是通过上调HIF-1(Hypoxia Inducible Factor-1,HIF-1)表达实现的。HIF-1是一种对氧敏感的核转录因子,由α和β两个亚基构成,其活性主要取决于α亚基。在缺血缺氧状态下,HIF-1α能够调控下游200多种促细胞生存基因的转录激活;而在常氧状态下,HIF-1α在胞浆中易被脯氨酸羟化酶(Proline Hydroxylase,PHD)羟化修饰,经泛素化途径降解失活,所以在再灌注时期HIF-1α难以发挥对心肌的保护效应。因此,研究人员多采用PHD抑制剂二甲基乙二酰基甘氨酸(Dimethyloxalyglycine,DMOG)稳定HIF-1α表达,使HIF-1α对心肌的保护效应得以持续,然而这种方法稳定HIF-1α表达的时间规律如何,是决定急性实验中取材时间点选择的关键因素,但目前未见相关报道。因此,本研究的第一部分拟从整体动物水平,结合分子生物学检测手段,观察DMOG预处理对I/R心肌组织中HIF-1α表达量影响的时间规律,为后续HIF-1α的功能研究提供实验依据。大量研究发现,线粒体功能障碍是导致心肌I/R损伤、诱导心肌细胞凋亡的一种重要病理机制,包括线粒体ROS爆发性产生、钙离子超载、线粒体内外膜之间的通透性转换孔(mPTP)持续开放等。mPTP开放可使线粒体基质中促凋亡因子与细胞色素C(Cyt c)释放,进而激活Caspase-3,促进细胞凋亡的发生;同时线粒体基质水肿,外膜破裂,线粒体膜电位被破坏,加速能量耗竭。因此,保护线粒体功能已成为改善心肌I/R损伤的关键。我们的前期研究发现,稳定HIF-1α表达可通过抑制线粒体途径介导的心肌细胞凋亡而发挥对心肌I/R损伤的保护作用,然而HIF-1α的心肌保护效应是否与改善线粒体功能障碍有关,目前尚不清楚。因此,本研究的第二部分拟在第一部分实验确定DMOG稳定HIF-1α表达最佳时间点的基础上,观察HIF-1α对心肌I/R线粒体功能的影响,为HIF-1α心肌保护机制的阐明提供新的思路。第一部分dmog稳定缺血/再灌注心肌组织hif-1α表达的时间规律目的:观察dmog预处理对大鼠i/r心肌组织中hif-1α表达量影响的时间规律,为后续hif-1α功能研究提供实验依据。方法:选取8周龄,220~260g雄性wistar大鼠78只,随机分为4组:sham,mi/r,d+mi/r,yc-1+mi/r(yc-1为hif-1α抑制剂)。水合氯醛麻醉大鼠,心电监测,打开胸腔行冠状动脉左前降支结扎术(ligationoftheleftanteriordescendingcoronaryartery,lad),心肌缺血45min,再灌注0h,3h,6h,9h四个时间点。留取心脏左室前壁标本,分别采用real-timepcr和westernblot方法检测心肌组织中hif-1αmrna与蛋白表达水平。结果:westernblot结果显示:随着再灌注时间的延长,sham组在再灌注不同时间点hif-1α蛋白表达量无明显差异且保持在较低水平(1±0.11);而mi/r组在再灌注0h时表达量最高(1.55±0.17),随后逐渐降低;d+mi/r组的hif-1α蛋白表达量则表现为先增高、后降低趋势,再灌注3h时达峰值(2.88±0.21,p<0.05);yc-1+mi/r组与sham组类似,在再灌注不同时间点hif-1α蛋白表达量无明显差异且保持在较低水平(0.03±0.01)。与mi/r组相比,d+mi/r组在再灌注同一时间点hif-1α蛋白表达量明显增加,各时间点的增加倍数分别为:0h,1.35倍(p<0.05);3h,3.9倍;6h,7.7倍;9h,5.0倍(3h,6h,9h均p<0.01)。yc-1+mi/r组与mi/r组相比,hif-1α蛋白表达量在再灌注0h、3h时间点明显降低(p<0.05),6h、9h两组之间并无明显差异(p﹤0.05)。real-timepcr检测结果显示:sham组,mi/r组,d+mi/r组,yc-1+mi/r组在再灌注各时间点的hif-1αmrna表达量均无明显差异(p﹤0.05);且组间相同时间点进行多重比较也无明显差异(p﹤0.05)。结论:1.dmog预处理能够稳定心肌i/r时hif-1α的蛋白表达,在再灌注3h时表达量达峰值;2.dmog预处理对hif-1α表达的影响主要发生在蛋白合成水平,而非基因转录水平。第二部分稳定hif-1α表达对缺血/再灌注心肌组织线粒体功能的影响目的:观察稳定hif-1α表达对i/r心肌组织线粒体功能的影响,探讨hif-1α发挥心肌保护效应的可能机制。方法:选取220~260g成年雄性wistar大鼠24只,随机分为4组:sham,mi/r,d+mi/r,yc-1+mi/r。水合氯醛麻醉大鼠,心电监测,打开胸腔,行lad,心肌缺血45min,再灌注3h后处死动物,留取大鼠心脏左室前壁心肌组织标本,提取心肌组织中的线粒体,jc-1染色法测定线粒体膜电位,elisa法检测胞浆和线粒体中细胞色素c的含量。结果:荧光显微镜下观察可见:sham组红色荧光强度明显高于绿色荧光,表明该组心肌细胞中线粒体膜电位较高;与sham组相比,mi/r组红色荧光强度明显减弱,绿色荧光强度增加,表明线粒体基质中聚合体形式的jc-1较少,线粒体膜电位下降;与mi/r组相比,d+mi/r组红色荧光强度明显增强,绿色荧光强度减弱;而yc-1+mi/r组的绿色荧光强于红色荧光,说明线粒体膜电位最低。比较各组的红色/绿色荧光强度值(R/G RFU):与Sham组相比,MI/R组的R/G RFU较低(4.497±0.189 vs.9.840±0.325,P<0.01);而D+MI/R组则较MI/R组的R/G RFU明显增加(7.908±0.538 vs.4.497±0.189,P<0.01);YC-1+MI/R组的R/G RFU值却明显低于MI/R组(P<0.01)。当线粒体mPTP开放时,线粒体中的Cyt c可释放入胞浆,导致线粒体与胞浆的Cyt c比值(mito-Cyt c/cyt-Cyt c)降低,因此检测mito-Cyt c/cyt-Cyt c可反映mPTP的开放状态以及线粒体功能是否受损。本实验中mito-Cyt c/cyt-Cyt c测定结果显示:MI/R组较Sham组比值降低了73%(P<0.01);而DMOG则部分逆转了MI/R所致的mito-Cyt c/cyt-Cyt c值降低,D+MI/R组为MI/R组的2.4倍(P<0.01);YC-1+MI/R组的该值却明显低于MI/R组(P<0.01)。结论:稳定HIF-1α表达可明显抑制心肌I/R所致的线粒体膜电位降低,并减少线粒体Cyt c释放,提示HIF-1α对心肌I/R的线粒体功能障碍具有保护作用,这可能是HIF-1α抑制心肌细胞凋亡的机制之一。