背景与目的 大肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，最近的资料表明，我国大肠癌发病率居恶性肿瘤第四位，近年来呈明显的上升趋势。因此，研究大肠癌的发生、发展、凋亡及分化的分子生物学机制是具有迫切和现实意义的课题之一。 大量的流行病学和体内外实验研究已经证实，高纤维食物与大肠癌发病率降低及抑制大肠癌生长有关。丁酸是由大肠共生细菌发酵食物纤维而产生的短链四碳脂肪酸，丁酸及其钠盐在生理浓度下即可抑制大肠癌细胞的生长，诱导大肠癌细胞分化及凋亡，从而具有防癌作用。有文献报导，丁酸钠(sodium butyrate，NaB)可以诱导人的子宫内膜癌细胞和卵巢癌细胞及胃癌细胞凋亡，诱导人肝癌细胞及人脑多型性胶质母细胞瘤分化，诱导高转移肺癌细胞恶性表型发生逆转等。但其作用机制尚不完全清楚。目前研究认为，NaB主要是通过组蛋白的超乙酰化进而引起一些基因的表达，最终抑制细胞生长，诱导其凋亡。以往对大肠癌的研究主要集中于细胞周期相关的蛋白和相关的基因方面，而对于caspase-3这一凋亡通路中关键蛋白报道较少，说明其诱导机制研究还不尽全面。因此，在这些研究的基础上，我们用NaB处理体外培养的人大肠癌细胞CCL-187，研究了NaB对CCL-187细胞的生长抑制和诱导凋亡作用，同时应用Western Blot方法分析NaB诱导后细胞中caspase-3蛋白的表达情况，为完善其凋亡机制的研究提供实验证据。也为NaB能够成为潜在的新型抗肿瘤药物提供进一步的理论依据。 实验材料与方法 本实验应用培养的高分化人大肠癌细胞CCL八87，检测NaB对其细胞的生长抑制作用。收集处于对数生长期的细胞，以IX10’细胞／mL浓度接种细胞，培养24 ／J’时贴壁后加药处理。NaB用去离子水配制成0．4moUL的贮存液，4℃保存，使用终浓度分别为20 mM／0 InM斤0mMNaB，对照组加人等体积生理盐水。用MTh法检测细胞生长抑制作用；倒置相差显微镜，荧光显微镜，电镜技术观察细胞的形态结构变化；流式细胞仪检测细胞周期变化及 DNA含量分析；DNA琼脂糖凝胶电泳及 Western Blot法进行分子生物学检测。 实验结果 MTT的结果表明，在20InMNaB的作用下细胞生长率由94．7％下降到34．2％，40mM的作用下由86．2％下降到12．2％。显示 NaB对 CCL刁 细胞具有生长抑制作用，且呈时间－剂量依赖性。倒置相差显微镜下观察，经20mMNaB处理48 ／J’时后，细胞变化不明显；经40InMNaB处理48 ／J’时后，细胞变圆，细胞体变小，部分细胞悬浮；经60mMNaB处理48 ／J’时后，细胞大量漂浮，胞体崩解，出现大量细胞碎片等死亡现象。荧光显微镜下，对照组细胞染色质在核内分布均匀一致，呈现蓝色荧光；而经NaB处理48 ／J’时的实验组细胞染色质发生明显的变化，染色质高度聚集并分块呈现亮蓝色荧光的凋亡迹象。透射电镜下观察，CCL－187细胞经 40mMNaB处理 48 ／J’时后，可见染色质沿核膜聚集＼凝缩，核膜皱褐内陷，可见核膜包裹的凋亡小体；而对照组细胞核质比大，细胞器不发达，染色质分布均匀。流式细胞仪对经不同浓度的NaB ·2·处理人大肠癌细胞48小时后的分析结果表明，对照组呈现典型的二倍体峰；经20mMNaB处理48 ／J’时后的实验组出现亚二倍体峰，亚二倍体细胞百分率为 10．16％；经 40mMNaB处理 48 ／J’时后的实验组也出现亚二倍体峰，而且峰值明显高于前者，说明随药物浓度的增加亚二倍体峰逐渐升高，亚二倍体细胞百分率为30．53％；而经 60mMNaB处理 48 ／J’时后的实验组二倍体峰比值很小，为 7．sl％，而亚二倍体峰值高达86．46％，说明细胞发生大量坏死；而经 60mMNaB处理 12 ／J＼时后的实验组亚二倍体细胞百分率为 38．12％。此结果表明，NaB抑制CCL－187细胞生长，诱导其凋亡作用具有时间－剂量依赖性。琼脂糖凝胶电泳结果显示，实验组经NaB诱导48／J’时后，出现细胞凋亡典型的DNA ndder，40mM的NaB作用与20mM的作用相比，DNA ndder的强度变化不大，表明可能出现了细胞坏死，60InM NaB作用下的细胞无DNA ndder出现，同时有膜状条带，说明细胞大量坏死。Weste。Blot分析结果为，经20mM的NaB处理48 ／J’时后，细胞有少量casPase－3酶原被分解为20KD的具有活性的caspase－3片段；经48 ／J’时。40 mMNaB处理后，活性的casPase－3片段的表达浓度加强，而对照组和60mM组无活性caspase－3的片段，说明末经诱导的和大剂量处理后的细胞门坏死细胞）无caspase－3的表达，而中A剂量处理后的细胞有casPase－3的表达，并且表达水平随剂量增加而逐渐升高。 结 论 二．丁酸钠能够在体外显著地抑制人大肠癌细胞CCL1 的生长，并诱导其凋亡。 2．丁酸钠抑制人大肠癌细胞CCL－187的生长，诱导其凋亡呈现时间－剂量依赖性。 ·3· 3．丁酸钠可以诱导人大肠癌细胞CCLJ87表达促进凋亡的关键