研究背景胃癌的发病率和死亡率高居全球恶性肿瘤的第4和第3位,为我国最常见的恶性肿瘤之一。近年来研究表明,胃癌的发生发展是一个多因素、多阶段、多基因异常表达累积的病变过程。除经典的基因缺失与突变机制外,表观遗传学的改变在胃癌的发生发展过程中逐渐受到重视,其中基因启动子异常甲基化被认为是调控基因表达的第三种重要机制。肿瘤抑癌基因(tumor suppressor gene,TSG)是生物体内细胞增殖、分化和凋亡过程中的负性调节因子之一。由抑癌基因启动子高甲基化引起的基因失活有助于细胞的无限制生长,促进肿瘤的形成。因此,对这方面进行研究有助于解释细胞增殖、分化和癌变等过程。抑癌基因异常甲基化常在肿瘤早期被检测出来,通过筛选胃癌相关的基因甲基化谱,能为肿瘤的早期诊断、治疗和预后提供理论及实验依据。研究目的通过分析胃癌组织中抑癌基因p16、hMLH1和CDH1启动子区甲基化状态及其蛋白表达水平,明确两者之间的相关性;统计分析这3个基因启动子区甲基化状态和蛋白表达水平与临床病理参数、预后参数之间的关系,揭示这3个基因在胃癌发生发展中的作用;在胃癌细胞系和正常胃黏膜上皮细胞系中过表达抑癌基因hMLH1,通过细胞功能实验,初步探讨hMLH1在胃癌中的抑癌作用机制。研究方法1、检测胃癌组织中p16、hMLH1和CDH1基因启动子区甲基化及其与临床病理特征和预后的关系随机选择经病理确诊的120例原发性胃癌患者,所有患者术前均未行放疗和化疗,收集胃癌根治术后肿瘤组织及其相距5cm的配对癌旁组织。用QIAampDNA Mini Kit试剂盒提取DNA,继以亚硫酸氢盐转化。采用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)方法检测上述样本中 p16、hMLH1 和 CDH1 基因启动子CpG岛甲基化的状况,在SPSS 18.0统计软件中用卡方检验或Fisher精确检验分析每个基因甲基化程度与临床病理参数之间的关系。探讨p16、hMLH1和CDH1基因甲基化状态与患者总体生存期的关系用Kaplan-Meier法。整体比较采用Log-rank检验并绘制生存曲线。2、检测胃癌组织中p16、hMLH1和E-cadherin蛋白表达水平及其与临床病理特征和预后的关系对120对胃癌组织和癌旁组织进行常规苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin staining,HE)染色和免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)染色。所有步骤依据产品说明书进行,利用PBS(0.01mol/L,pH7.4)替代I抗作为阴性对照。免疫组化染色结果判定:p16和E-cadherin蛋白免疫染色阳性信号定位于细胞浆,hMLH1蛋白免疫染色阳性信号定位于细胞核,呈棕黄色颗粒,每个标本观察2个有代表性的高倍视野,每个视野计数100个细胞,确定阳性细胞数所占的百分比并取它们的平均值,阳性细胞数≤20%为阴性(-),阳性细胞数>20%为阳性(+)。在SPSS 18.0统计软件中用卡方检验或Fisher精确检验分析每个蛋白表达与临床病理学参数之间的关系。探讨p16、hMLH1和E-cadherin蛋白表达水平与患者总体生存期的关系用Kaplan-Meier法。整体比较采用Log-rank检验并绘制生存曲线。用Spearman相关性分析探讨基因启动子甲基化状态与其蛋白表达之间的关系。3、胃癌细胞系和正常胃黏膜细胞系中hMLH1基因启动子区甲基化和mRNA表达水平检测体外培养胃癌细胞系(MKN-74、MKN-45、SGC-7901、HGC-27、MGC-803、BGC-823和AGS)和正常胃黏膜上皮细胞系GES-1。细胞接种于含10ml/L胎牛血清(56℃灭活30min)及DMEM/F12培养基中,在37℃、含5%CO2的湿润空气的恒温密闭式培养箱中培养。取对数生长期的细胞数1×106进行细胞DNA抽提及重亚硫酸氢盐转化,采用MSP方法检测8种细胞株中hMLH1基因启动子甲基化状况。用Trizol试剂提取细胞总RNA,并按RT-PCR试剂盒说明书进行反转录合成cDNA;荧光定量PCR扩增,分析各细胞系中hMLH1基因mRNA的相对表达水平。获得启动区子高甲基化且mRNA表达水平下降的胃癌细胞系。4、克隆形成检测和Transwell实验构建野生型hMLH1基因慢病毒表达载体(LV-GFP-MLH1),转染启动区子高甲基化且mRNA表达水平下降的胃癌细胞系AGS,建立稳定表达外源性hMLH1和阴性对照AGS细胞株。采用克隆形成实验检测hMLH1过表达对AGS细胞克隆形成能力的影响;Transwell实验分析hMLH1过表达对AGS细胞侵袭能力的影响。研究结果1、MSP检测结果显示,120例胃癌组织中p16、hMLH1和CDH1基因启动子区甲基化阳性率分别是 36.67%(44/120)、24.17%(29/120)和 25.00%(30/120);癌旁组织中p16、hMLH1和CDH1基因启动子区甲基化阳性率分别是25.83%(31/120)、8.33%(10/120)和 14.17%(17/120)。hMLH1 和 CDH1 两个基因甲基化阳性率在胃癌组织与癌旁组织之间的差异均具有统计学意义(P<0.05)。2、hMLH1基因甲基化状态与饮酒(P=0.019)、CA199水平(P<0.001)和Borrman分型(P = 0.030)有关,有饮酒史患者其hMLH1甲基化率(40.00%)高于无饮酒史患者(18.89%);CA199>37kU/L的胃癌患者其hMLH1甲基化率(53.57%)高于CA199≤37kU/L的胃癌患者(15.22%);Borrman Ⅰ型和Ⅱ型患者其hMLH1甲基化率(66.67%)高于Ⅲ型和Ⅳ型患者(21.93%)。CDH1基因甲基化状态与血清癌胚抗原(CEA)水平有关(P = 0.003),CEA>5μg/L的胃癌患者其CDH1甲基化率(46.43%)高于CEA≤5μg/L的胃癌患者(18.48%)。hMLH1基因启动子甲基化与胃癌患者总体生存相关,是独立预后因子,hMLH1基因高甲基化胃癌患者预后更差。p16和CDH1基因启动子区甲基化各自与胃癌患者总体生存期无关,但在联合分析中,携带2个或3个基因甲基化的患者的总体预后比携带0个或1个基因甲基化的患者差(χ~2= 3.901,P = 0.048)3、免疫组化结果显示,120例胃癌组织中p16、hMLH1和E-cadherin蛋白表达阳性率分别是:36.67%(44/120)、69.17%(83/120)、68.33%(82/120);癌旁组织中,p16、hMLH1和E-cadherin蛋白表达阳性率分别是:86.67%(104/120)、94.17%(113/120)、92.50%(111/120)。p16,hMLH1 和 E-cadhein 蛋白表达阳性率在胃癌组织与癌旁组织之间的差异均具有统计学意义(P<0.05)。4、胃癌p16蛋白表达水平与肿瘤大小有关(P = 0.030),肿块直径<6cm患者其p16表达阳性率(44.44%)高于肿块直径≥6cm的患者(25.00%)。hMLH1蛋白表达水平与肿瘤标记物CA199(P = 0.041)、肿瘤大小(P = 0.036)有关,CA199>37kU/L的胃癌患者其hMLH1蛋白表达阳性率(53.57%)低于CA199≤37kU/L几的胃癌患者(73.91%);肿块直径<6cm的患者其hMLH1表达阳性率(76.39%)高于肿块直径≥6cm患者(58.33%)。E-cadherin蛋白表达情况与饮酒(P = 0.041)有关,有饮酒史胃癌患者其E-cadherin表达阳性率(53.33%)低于无饮酒史患者(73.33%)。p16、hMLH1和E-cadherin蛋白表达水平与胃癌患者总体生存期无关。胃癌组织中hMLH1基因甲基化与其蛋白表达存在负相关性(P=0.005)5、胃癌细胞系(MKN-74、MKN-45、SGC-7901、HGC-27、MGC-803、BGC-823和AGS)中hMLH1基因启动子均为甲基化,正常胃黏膜上皮细胞系GES-1中hMLH1为非甲基化。各胃癌细胞系中hMLH1的mRNA表达水平均低于正常胃黏膜上皮细胞系。将加MLH1基因过表达病毒感染的AGS细胞组标记为实验组,加阴性对照病毒感染的AGS细胞组标记为对照组。克隆形成实验显示,对照组和实验组的克隆形成数分别是180±3个和169±6个,实验组的克隆形成数高于对照组(P= 0.039)。Transwell实验结果显示,对照组和实验组的穿膜细胞数分别为135±4.08个和125±4.18个,实验组的穿膜细胞数高于对照组(P = 0.048)。结论胃癌组织中p16、hMLH1和CDH1基因启动子区异常甲基化是频发事件,多个抑癌基因启动子区异常甲基化同时存在可能是胃癌发生发展的重要机制之一。hMLH1和CDH1基因启动子区甲基化可能是胃癌癌变过程中的重要分子事件,是胃癌早期诊断的潜在分子标志物。hMLH1基因启动子区甲基化可通过下调其基因表达,促进胃癌细胞的克隆形成并增强侵袭能力,从而参与胃癌的发生发展。hMLH1启动子甲基化与胃癌患者总生存相关,是胃癌患者预后的独立危险因素;同时,多个基因甲基化也与预后相关,可为胃癌患者的精准治疗和预后预测提供理论依据。