论文部分内容阅读
背景肾间质纤维化是各种慢性肾脏疾病进展至终末期肾衰的共同途径。上皮间质转分化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)是启动和维持肾间质纤维化的关键机制,也是肿瘤浸润和转移的重要调控机制。TGF-β/Smads是调节EMT和肾间质纤维化的关键信号通路,Snail是EMT过程和TGF-β/Smads信号通路的关键早期即刻转录因子。转录因子Snail抑制E-cadherin表达,诱导肾小管上皮细胞以及肿瘤细胞的EMT。去甲斑蝥素(Norcantharidin, NCTD)是斑蝥素的重要衍生物,是一种特异性蛋白磷酸酶抑制剂,具有抗肿瘤活性。近期,斑蝥素抗肿瘤作用的研究发现,斑蝥素可通过抑制高转移卵巢癌细胞株Smad3和核因子κB (Nuclear Factor-kappa B, NF-κB) p65的表达,降低调控肿瘤转移相关靶基因如血管内皮细胞生长因子(VEGF)、粘着斑激酶(FAK)及转化生长因子-β(TGF-β)的表达水平、维持基质金属蛋白酶2/基质金属蛋白酶抑制剂(MMP2/TIMP)动态平衡。我们以往研究首次发现去甲斑蝥素不仅可以降低蛋白超负荷肾病大鼠尿蛋白水平,而且还具有抑制肾病大鼠肾组织局部结缔组织生长因子和NF-KBp65的高表达、改善肾小管间质病理损伤、减轻肾间质纤维化的作用。另外,体外实验显示去甲斑蝥素可以抑制白蛋白介导的肾小管上皮细胞纤维粘连蛋白(Fibronectin, FN)的表达。但去甲斑蝥素作用的详细分子机制尚不清楚。第一章去甲斑蝥素抑制单侧输尿管梗阻大鼠肾小管上皮间质转分化的研究目的利用UUO大鼠模型,初步观察NCTD对肾小管上皮间质转分化的影响,旨在探讨NCTD抑制EMT的作用,阐明NCTD减轻肾纤维化的机制。方法SD大鼠随机分为假手术组(Sham组)、模型组(UUO组)和UUO+去甲斑蝥素治疗组(NCTD组),每组6只。采用单侧(左)输尿管结扎方法,建立梗阻性肾小管间质纤维化大鼠模型(Ping Xie, Lin Sun, et al. JASN,2009,Apr;20(4):807-19.), Sham组只游离输尿管而不结扎。术后14天处死动物,取结扎侧肾脏,同时处死假手术组大鼠,取出肾组织。采用HE、Masson染色观察各组之间肾脏病理学变化,采用RT-PCR及免疫组化、Western blot等方法检测TGF-β1、E-cadherin与α-SMA基因和蛋白表达的变化。结果光镜下假手术组大鼠肾组织无明显变化,UUO组和NCTD组大鼠肾组织出现不同程度的肾小管扩张、间质炎症细胞浸润、间质面积增宽、部分肾小管萎缩、肾小管上皮细胞空泡样变性,但是,与模型组比较,NCTD组病变程度减轻。RT-PCR、免疫组化及Western blot均显示,与假手术组比较,UUO组肾组织TGF-β1表达上调、α-SMA表达上调、E-cadherin表达下调；与UUO组比较,NCTD组TGF-β1表达明显下调、α-SMA表达显著下调,而E-cadherin表达上调。结论去甲斑蝥素具有减轻UUO大鼠肾间质纤维化和抑制肾小管上皮间质转分化的作用,该作用可能与抑制TGF-β1的过表达有关。第二章去甲斑蝥素通过下调信号蛋白Smad2/3、转录因子Snail1抑制人肾小管细胞上皮间质转分化目的探讨去甲斑蝥素对体外人源性近端肾小管细胞株(HK-2)EMT的影响,研究信号蛋白Smad2/3、转录因子Snail1在其中的作用。方法常规培养HK-2细胞,分为对照组、TGF-β1组、NCTD组。对照组为无血清DMEM培养,TGF-β1组为TGF-β1 5ng/ml诱导,NCTD组为不同浓度NCTD (0.5、1.0、2.5μg/ml)与TGF-β1 (5ng/ml)共同作用,各组作用时间48小时。采用RT-PCR、免疫荧光与Western blot分别检测α-SMA与E-cadherin表达水平的变化。采用RT-PCR检测Smad2、Smad3、Snail1 mRNA表达,采用Western blot检测Smad2/3与Snail1蛋白表达。选取NCTD 2.5μg/ml作用0、15min、30min、60min以及120min不同时间点,采用Western blot检测磷酸化的Smad2/3蛋白表达变化。结果RT-PCR、免疫荧光与Western blot均显示,与对照相比,TGF-β1组α-SMA mRNA和蛋白表达上调,E-cadherin mRNA和蛋白表达下调；与TGF-β1组相比,NCTD组α-SMA mRNA和蛋白表达下调,而E-cadherin mRNA和蛋白表达上调,且呈一定的剂量依赖关系。RT-PCR和Western blot均显示,与对照相比,TGF-β1组Smad2、Smad3 mRNA和Smad2/3蛋白表达上调,且磷酸化Smad2/3蛋白水平上调；与TGF-β1组比较,NCTD组Smad2、Smad3 mRNA和Smad2/3蛋白表达下调,呈剂量依赖性,且磷酸化Smad2/3蛋白水平显著下降；RT-PCR和Western blot均显示,与对照相比,TGF-β1组Snail1 mRNA和蛋白表达上调；与TGF-β1组比较,NCTD干预组Snail1 mRNA和蛋白表达下调,呈剂量依赖性。结论去甲斑蝥素具有抑制肾小管上皮细胞EMT的作用,该作用可能与下调TGF-β1下游信号蛋白Smad2、Smad3以及转录因子Snail1的表达有关。