研究背景:蛛网膜下腔出血(Subarachnoid Hemorrhage,SAH)是一种高死亡率、高致残率的神经外科急症。动脉瘤性蛛网膜下腔出血是SAH最常见的类型,约占全部病例的85%。在过去很长的一段时间里,迟发性脑血管痉挛一直被认为是引起SAH患者预后不良的主要原因,然而在近20年的研究中,该研究方向并没有取得突破性进展,越来越多的证据表明SAH后除迟发性脑血管痉挛外,还存在其他重要的机制造成SAH患者预后不良。近年来,领域内的权威专家提出了早期脑损伤(Early Brain Injury,EBI)概念,即从SAH开始至72小时这一时间窗之内的脑损伤。EBI是一个非常复杂的病理生理过程,所涉及的分子机制十分复杂,包括炎症因子的释放、氧化应激的产生、谷氨酸的毒性作用、脂质过氧化、钙离子通道的开放、细胞凋亡或坏死等。截止目前,大量动物实验已经证实,神经细胞死亡和神经炎症反应是EBI的两大主要损伤机制。褪黑素是一种由松果体分泌的神经内分泌激素,易渗透血脑屏障(Blood Brain Barrier,BBB),具有良好的生物耐受性。近年来,褪黑素逐渐被证明可以通过减少氧化应激,抑制炎症反应,激活自噬和抑制凋亡等多种机制在SAH疾病中发挥神经保护作用。然而,这其中涉及的具体机制仍有待进一步深入研究。因此,本研究将从抑制EBI两大主要损伤机制,即抗细胞死亡及抗神经炎症两个方面对褪黑素在SAH中的保护机制展开研究。第一部分研究将着眼于坏死性凋亡这种新型的细胞死亡方式,观察坏死性凋亡机制是否参与了 SAH的致病过程,并且进一步探讨褪黑素治疗对于坏死性凋亡的作用及其可能机制。第二部分研究主要着眼于褪黑素调控NLRP3炎症小体介导炎症反应的可能机制。实验方法:第一部分1.采用线栓穿刺法制作蛛网膜下腔出血(SAH)模型,成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠随机被分为假手术组(Sham组)和蛛网膜下腔出血组(SAH组)。SAH组按取材时间不同又分为蛛网膜下腔出血后6h组(SAH 6h组)、蛛网膜下腔出血后12h组(SAH12h组)、蛛网膜下腔出血后24h组(SAH24h组)、蛛网膜下腔出血48h组(SAH48h组)和蛛网膜下腔出血后72h组(SAH72h组),通过蛋白质免疫印迹检测各组SD大鼠同侧大脑皮质内RIPK3蛋白含量;通过双重免疫荧光染色观察RIPK3的细胞定位;通过碘化丙啶(PropidiumIodide,PI)染色鉴定坏死神经细胞及其与RIPK3的关系;通过透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope,TEM)观察坏死神经细胞的超微结构变化。2.成年雄性SD大鼠随机被分为假手术+溶剂组(Sham组),蛛网膜下腔出血+溶剂组(SAH+溶剂组),蛛网膜下腔出血+GSK872处理组(SAH+GSK872组),根据各分组不同的药物治疗情况,SAH模型建立后30分钟,应用立体定位下侧脑室注射法分别给予溶剂或RIPK3抑制剂GSK872,SAH后72小时通过免疫荧光等方法评估各组的细胞死亡,脑水肿和神经功能等情况。3.成年雄性SD大鼠随机被分为假手术+溶剂组(Sham组),蛛网膜下腔出血+溶剂组(SAH +溶剂组),蛛网膜下腔出血+褪黑素处理组(SAH+Mel组),根据各分组不同的药物治疗情况,SAH模型建立后2小时、24小时和48小时,分别给予溶剂或褪黑素腹腔注射,SAH后72小时通过蛋白质免疫印迹、免疫荧光等方法评估各组相关蛋白的表达,细胞死亡,脑水肿和神经功能等情况。4.成年雄性SD大鼠随机被分为蛛网膜下腔出血+溶剂组(SAH +溶剂组),蛛网膜下腔出血+褪黑素处理组(SAH+Mel组),蛛网膜下腔出血+褪黑素+3-MA处理组(SAH+Mel+3-MA组),根据各分组不同的药物治疗情况,SAH模型建立前20分钟,给予脑室内注射溶剂或3-MA,术后2小时,24小时和48小时,给予溶剂或褪黑素腹腔注射,SAH后72小时通过蛋白质免疫印迹、免疫荧光等方法评估各组相关蛋白的表达,细胞死亡,脑水肿和神经功能等情况。第二部分采用线栓穿刺法制作蛛网膜下腔出血(SAH)模型,成年雄性SD大鼠随机被分为假手术+溶剂组(Sham组),蛛网膜下腔出血+溶剂组(SAH+溶剂组),蛛网膜下腔出血+褪黑素处理组(SAH+Mel组)和蛛网膜下腔出血+褪黑素+3-MA处理组(SAH+Mel+3-MA组),根据各分组不同的标准,SAH模型建立前20分钟,给予脑室内注射溶剂或3-MA,术后2小时给予溶剂或褪黑素腹腔注射。24小时后获取大脑标本,通过脑含水量检测、活性氧测定、蛋白免疫印迹、免疫组织化学和透射电子显微镜等方法检测线粒体自噬、NLRP3炎症小体等相关指标。结果:第一部分1.SD大鼠蛛网膜下腔出血后6个小时,脑组织中RIPK3的表达升高,12小时出现一个较小幅度的下降,接着再度上升,在72小时到达峰值。2.通过PI染色及透射电镜观察到大鼠脑组织在蛛网膜下腔出血后72小时出现坏死的神经元,且RIPK3主要位于神经元中。3.褪黑素能降低RIPK3和MLKL的表达,并减少坏死神经元的数量及HMGB1的释放。褪黑素能通过减少血脑屏障的破坏而减轻水肿,从而能够在蛛网膜下腔出血72小时后改善神经功能。4.自噬抑制剂3-MA能逆转褪黑素对于缓解RIPK-3介导的坏死性凋亡的作用。第二部分1.SAH后褪黑素治疗上调线粒体自噬相关蛋白(PINK1/Parkin),减轻线粒体损伤,减少ROS产生。2.SAH后褪黑素治疗抑制NLRP3炎症小体激活,减少炎症反应。3.SAH后褪黑素治疗减少神经细胞的死亡,减轻脑水肿和缓解神经功能障碍。4.自噬抑制剂3-MA预处理可逆转褪黑素治疗对于NLRP3炎症小体活化的抑制作用。结论:1.本研究证实RIPK3介导的坏死性凋亡与SAH的早期脑损伤有关。褪黑素能减轻RIPK3介导的坏死性凋亡,减少HMGB1胞浆易位、保护血脑屏障及减轻脑水肿,从而改善SAH后的神经功能。而这其中潜在的机制可能与自噬的激活密切相关。2.褪黑素介导的线粒体自噬相关蛋白上调能够在SAH后早期脑损伤中起到神经保护作用,并且该神经保护作用机制与抑制NLRP3炎症小体激活和减少炎症反应相关。