肝脏疾病（如肝炎、肝硬化）在我国具有很高的发病率，这些疾病最终导致肝功能衰竭，如何治疗肝功能衰竭目前仍然是肝病临床的一大难题，虽然现在公认的最好的治疗方式是肝移植，但是由于受到供体来源缺少的限制和移植后的免疫排斥反应，而不能广泛应用。自70年代末发展起来的肝细胞移植技术，具有许多优点：一个供体可以给多个受体提供肝细胞，移植技术简单，即使移植失败，对受体的影响也十分微小，因此受到越来越广泛的重视，在众多可供移植的细胞中，肝干细胞具有多向分化和增殖能力强的特点，其来源丰富，对于修复肝脏细胞、维持肝功能、治疗肝脏疾病，以及研究肝脏的发育学均具有重要意义。目前认为具有肝干细胞特性的细胞有：肝卵圆细胞、骨髓造血干细胞、胰腺前体细胞和胎肝前体细胞（HPFL）等。 研究目的：本实验以大鼠ED13.5d的HPFL为实验材料，目的在于探索：1)肝干细胞的体外分离培养的特点；2)肝干细胞的体外多向分化；3)体外扩增的肝干细胞植入体内的发育潜力；4)冻存复苏对肝干细胞的生物学特性的影响。以便为临床应用治疗肝脏疾病奠定基础。 研究方法：1)取ED13.5d的大鼠胎肝，酶消化法离散细胞，用红细胞裂解液去除红细胞，差速贴壁法去除其它细胞，接种于不同的基质和培养液中，MTT法比较不同培养液和培养基质对大鼠HPFL的体外生长影响。2)将初步纯化的ED13.5d的大鼠HPFL采用显微法进行克隆培养，免疫组化法 第四军医大学硕士学位论文筛选ALB”CK－19一的克隆进行诱导培养，观察ALB”CK－19一的细胞分化趋势。3)收集在原代大鼠成纤维细胞（PREF）饲养层上培养的原代HPFL，注人SCto鼠脾脏，观察HPFL植人体内的增殖发育情况／)将分离的大鼠ED13．sd的HPFL分别冻存3周和6周，检测细胞的活性和贴壁率的变化，以及分泌白蛋白等情况，观察冻存因素对HPFL的生物学功能的影响。 研究结果：1)含有 EGF的 DMEM：FIZ对于 HPFL的体外增殖明显优于其它培养液；在不同的培养基质中，PREF饲养层优于明胶和胶原，可促进HPFL的生长，并能延缓 HPFL在体外的分化。2)HPFL在体外克隆诱导分化试验中，ALB”CK－19一细胞克隆中能诱导出 ALB”CK－19”细胞，结果说明HPFL具有向肝细胞和胆管细胞双向分化的能力。3)原代培养的HPFL植人SCto鼠脾脏后，结果发现能在牌内形成肝索样结构，并且＊七P酶活性试验呈阳性，显示出一定的肝细胞功能。4)冻存复苏对HPFL的生物学功能有一定影响，随着冻存时间的延长，复苏后的细胞活性和贴壁率有一定下降，白蛋白分泌峰值亦有所降低。 研究结论：HPFL具有干细胞的一般特性：具有很强的体外扩增和双向分化能力。尽管冻存复苏对HPFL的生物学功能有一定的影响，但HPFL仍可通过冻存长期保存，为“肝干细胞库”的建立提供了理论依据和实验数据。作为一种有潜力的备选细胞，HPFL所表现出的这些优于成熟肝细胞的特点，为临床应用治疗肝脏疾病，提供了一种新的选择。