甘草素对H2O2诱导的小鼠胚胎氧化损伤影响的研究

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随着国内外对哺乳动物体外受精及胚胎体外发育研究的日益深入,动物生物技术也开始备受关注。体外胚胎培养非常重要,然而,在体外胚胎生产与体内相比更加困难。在体外胚胎生产过程中,容易受到各种因素影响并产生过量的活性氧(ROS),破坏ROS平衡,从而使胚胎发生氧化损伤,氧化损伤影响胚胎发育,最终导致胚胎凋亡。氧化损伤是影响胚胎体外发育的关键因素,因此减少胚胎体外发育中的氧化损伤对研究胚胎体外发育机制和动物胚胎工程具有重大意义。改善和优化体外培养体系将会有效促进体外优质胚胎的生产,同时可以更好地贡献于胚胎生物工程技术和人类疾病动物模型上的应用。本论文旨在探究抗氧化剂甘草素(Liquiritigenin,LQ)对H2O2诱导的小鼠胚胎氧化损伤的影响,从抗氧化角度,阐明中药LQ在哺乳动物早期胚胎体外培养上的潜在机制,并为进一步开发和利用提供理论依据和研究思路。本试验设计四个试验组,即对照组(KSOM)、LQ处理组(LQ+KSOM)、H2O2处理组(H2O2+KSOM)、H2O2+LQ处理组(H2O2+LQ+KSOM),利用0、10、20、30、40、50μmol/L的甘草素处理昆明小白鼠的早期胚胎,比较不同试验组2-细胞率、4-细胞率和囊胚率,筛选出最适甘草素的浓度。收集上述四个试验组昆明小白鼠囊胚,利用DCFH-DA检测小鼠囊胚内ROS水平,利用CMF2HC检测小鼠囊胚内GSH水平,利用JC-1荧光染色法检测小鼠囊胚线粒体膜电位水平,最后对抗氧化酶相关基因(SOD1、CAT、GPx-1)、凋亡相关基因(BCL-2、Bax、Fas、Fas L、Caspase-3)、全能性相关基因(Oct-4)进行q RT-PCR反应,检测m RNA表达水平,以此来进一步评价LQ对H2O2诱导的小鼠胚胎氧化损伤的影响。试验结果如下:1、20μmol/L的LQ处理组2-细胞发育率、4-细胞发育率、囊胚发育率(P<0.05)均高于其他浓度组,因此在小鼠体外胚胎培养的最适浓度为20μmol/L。2、H2O2处理组的ROS水平显著高于对照组(P<0.05),极显著高于LQ处理组(P<0.01),但添加LQ以后,LQ降低了H2O2诱导的小鼠囊胚内ROS水平,与对照组水平相似。3、H2O2处理组的GSH水平显著低于对照组(P<0.05),极显著低于LQ处理组(P<0.01),但添加LQ以后,LQ升高了H2O2诱导的小鼠囊胚内GSH水平,与对照组水平相似。4、H2O2+LQ处理组比H2O2处理组显著增加线粒体膜电位(P<0.05),并抑制其凋亡。5、添加LQ可以上调抗氧化酶相关基因SOD1、CAT、GP1的m RNA转录表达水平,增强抗氧化作用。6、添加LQ可以上调抗凋亡基因BCL-2的表达水平,下调促凋亡相关基因Bax、Fas、Fas L、Caspase-3的表达水平,减少胚胎凋亡。7、添加LQ可以提高全能性基因Oct-4的m RNA表达水平,促进胚胎发育。综上所述,在体外培养小鼠胚胎过程中添加20μmo L/L的LQ,有效降低了H2O2诱导的氧化损伤小鼠胚胎的ROS水平、提高了GSH水平和线粒体膜电位水平。从分子角度,LQ调节了抗氧化酶相关基因、凋亡相关基因和全能性相关基因,从而有效缓解了H2O2诱导的小鼠胚胎的氧化损伤,对小鼠体外优质胚胎生产具有一定促进作用。
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