[目的]在炎症发生时,花生四烯酸经过脂加氧酶的催化下产生促炎症消退的脂类介质脂氧素A4。经过多年的研究发现脂氧素在炎症的消退的过程中发挥着重要的作用,然而脂氧素的产生机制仍然没有被完全阐明。本研究通过对血小板来源微颗粒的检测,从细胞和动物模型分别进行了研究,从新的角度阐明了体内和体外脂氧素合成的又一新的途径和机制。[方法]1.血小板来源微颗粒的分离与制备人或者鼠的外周血抗凝后提取血清中的血小板,经10μM ADP刺激后,利用高速离心的方法14000g×1h后提取血小板释放的微颗粒。2.血小板微颗粒中12-L0的检测将血小板来源的微颗粒提取后,用NP-40裂解液提取其总蛋白,然后采用免疫印迹的方法检测其12-LO的表达。3.经血小板来源微颗粒治疗后,LPS诱导的炎症模型中的相关因子的检测18-20g Balb/c小鼠腹腔注射2μg LPS1h后,再腹腔注射血小板来源的微颗粒。5h后,取腹腔灌洗细胞和灌洗液检测相关炎症因子IFN-γ,IL-6,IL-10,CCL2和iNOS的表达。4.经血小板来源微颗粒治疗后,DSS诱导的结肠炎模型中的相关因子的检测18-20g Balb/c小鼠饮用含3.5%DSS的饮用水,同时每只小鼠每天腹腔注射1×106血小板来源的微颗粒,每天记录体重。5-7天后,处死小鼠,观察结肠的变化并检测相关炎性因子IL-18,IFN-γ和TNF-α的表达。[结果]1.血小板来源的微颗粒中包含着12-LO人或者鼠的外周血抗凝后提取血清中的血小板,经10μM ADP刺激后,利用高速离心的方法14000g×1h后提取血小板释放的微颗粒。将血小板来源的微颗粒提取后,用NP-40裂解液提取其总蛋白,然后采用免疫印迹的方法检测其12-LO的表达。结果显示对照组和经ADP刺激的血小板来源的微颗粒中都有12-LO的表达。2.在体外肥大细胞摄取血小板来源的微颗粒后可以产生LXA4将骨髓来源诱导的肥大细胞与血小板来源的微颗粒进行共孵育,12h后用ELISA的方法检测培养上清中LXA4的表达。结果显示,仅在二者共孵育的上清中可以检测到LXA4的表达,而在单独的肥大细胞和单独的微颗粒培养上清中则没有LXA4的表达。3.在体内腹腔肥大细胞可以摄取血小板来源的微颗粒并产生LXA4将血小板来源的微颗粒用红色膜染料PKH26染成红色后腹腔注射到Balb/c腹腔中,6h后取腹腔细胞进行流式细胞染色,并取腹腔灌洗液检测LXA4的水平。结果显示大部分c-kit阳性的细胞(80.4%)都显示PKH26阳性,并且在腹腔灌洗液检测到了LXA4的表达。4.体内腹腔肥大细胞吞噬血小板来源的微颗粒产生的LXA4可以抑制LPS诱导的炎症18-20g Balb/c小鼠腹腔注射2μg LPS1h后,再腹腔注射血小板来源的微颗粒。5h后,取腹腔灌洗细胞和灌洗液检测相关炎症因子IFN-γ,,IL-6,IL-10,CCL2和iNOS的表达。结果发现,血小板来源的微颗粒注射组和LXA4注射组中IFN-γ表达均下降,而IL-10的表达则明显增加。5.体内腹腔肥大细胞吞噬血小板来源的微颗粒产生的LXA4可以抑制DSS诱导的结肠炎18-20g Balb/c小鼠饮用含3.5%DSS的饮用水,同时每只小鼠每天腹腔注射1×106血小板来源的微颗粒,每天记录体重。5-7天后,处死小鼠,观察结肠的变化并检测相关炎性因子IL-18,IFN-γ和TNF-α的表达。结果发现,血小板来源微颗粒注射组与DSS诱导组相比,结肠炎症受到明显抑制,体重下降较少,且IL-18,IFN-γ和TNF-α的表达较低。[结论]在体内和体外,肥大细胞可以摄取血小板来源的微颗粒利用其中的12-LO产生LXA4,产生的LXA4在LPS和DSS诱导的炎症模型中均有显著的抑制炎症和促炎症消退的作用。旧的]细胞能够形成各种大小不同的小泡,但是这些细胞来源的微小颗粒是否能用于药物传递仍不清楚。在不同的刺激下,细胞可以改变他们的细胞骨架结构并导致细胞内容物被细胞质膜封装,然后释放到细胞外。这种特殊的亚细胞微小颗粒直径100-1000nm,被称为微颗粒。1967年, Wolf第一次在活化的血小板中观察到了微颗粒,并描述为促凝血的“灰尘”。从那以后,科学家们逐渐发现微颗粒几乎可以来自所有的细胞类型并且具有重要的病理生理作用。微颗粒不仅包含各种信号分子、酶、RNA、甚至DNA,微颗粒还能将这些生物活性分子从一个细胞转到另一个细胞。因此,微颗粒在功能上就类似于在细胞之间传递分子信号的载体。考虑到微颗粒与人工纳米颗粒在大小、结构和载体功能上的相似性,我们合理推测微颗粒能够作为传递化疗药物的天然的药物载体。本项研究的目的就是为了证实微颗粒是否能作为化疗药物的载体达到更好的杀伤肿瘤的作用而展开的。[方法]1.微颗粒的分离与制备经化疗药物处理后的肿瘤细胞再经过紫外线UVB的照射,12h后取细胞悬液进行微颗粒的分离。分离采用密度离心的方法,首先600g*10分钟以去除细胞,之后取上清14000g*2分钟以去除细胞碎片,最后14000g*1小时离心得沉淀即为微颗粒,得到微颗粒后用培养基重悬备用。2.微颗粒的计数.采用流式细胞术的方法进行微颗粒的计数,将离心得到的微颗粒用0.1μm滤膜过滤的PBS重悬,然后加入已知数目的LB30微球,混匀后上机检测。收集10000LB30微球为基准,以N=10000×(微颗粒比例/LB30比例)的公式计算出微颗粒的数目。3.透射电镜检测微颗粒提取后经1μm滤膜过滤后室温条件下用4%多聚甲醛固定1小时,之后再次用1%四氧化锇固定后备用,最后进行超薄切片机切片后制成切片标本在透射电镜下观察微颗粒的形态。4.高效液相色谱肿瘤细胞来源的微颗粒包裹微颗粒后通过裂解液,蛋白酶K, PMSF, DNaseI处理再经有机溶剂萃取后进行高效液相色谱分析,数据采用Empower2软件分析。5.包裹化疗药物的微颗粒的细胞毒性检测肿瘤细胞经包裹化疗药物的微颗粒处理后,收集细胞采用PI和annexin V的方法对细胞进行染色,然后行流式细胞术检测细胞的凋亡情况。6.动物模型的构建6-8周的雌性Balb/c和Balb/c-SCID小鼠均购自湖北省实验动物中心(湖北,武汉)。利用H22细胞系构建小鼠的肝癌腹水模型,以及利用A2780腹腔注射Balb/c-SCID小鼠构建卵巢癌模型,并用包裹化疗药物的微颗粒进行治疗[结果]1.肿瘤细胞来源的微颗粒的形成为了检测凋亡肿瘤细胞是否能在化疗药物的诱导下形成包装了化疗药物的微颗粒。我们将CFSE标记了的鼠肝癌细胞系H22与10ug/ml的MTX(甲氨蝶呤)共同孵育,然后用紫外线照射诱导细胞进一步的凋亡。分离微颗粒,流式细胞术进行分析。结果发现,凋亡的肿瘤细胞确实可以释放大量的微颗粒2.肿瘤细胞来源的微颗粒包裹化疗药物后可以对肿瘤细胞进行杀伤为了检测包裹化疗药物肿瘤细胞来源的微颗粒是否对肿瘤细胞形成杀伤,我们将这样的微颗粒与肿瘤细胞进行不同时间点的孵育,结果发现微颗粒对肿瘤细胞形成了较强的杀伤。3.包裹化疗药物的肿瘤细胞来源的微颗粒可以抑制H22细胞产生的腹水并不伴发明显的副作用为了检测包裹化疗药物肿瘤细胞来源的微颗粒在体内是否对肿瘤细胞也形成杀伤,我们构建了H22细胞的腹水模型,然后行负载化疗药物的微颗粒治疗。结果发现负载药物的微颗粒治疗组可以明显的抑制腹水的形成,并且不伴发明显的化疗药物的副作用。4.包裹化疗药物的肿瘤细胞来源的微颗粒可以抑制A2780细胞产生的卵巢癌并不伴发明显的副作用为了进一步证明包裹化疗药物的微颗粒在体内对肿瘤的抑制作用,我们构建了A2780细胞的SCID小鼠人卵巢癌模型。数据显示,负载药物的微颗粒治疗组可以显著延长SCID小鼠的生存期。5.肿瘤细胞来源的微颗粒可以被肿瘤细胞吞噬为了证明肿瘤细胞来源的微颗粒可以与肿瘤细胞进行特异性的结合,将微颗粒和肿瘤细胞分别进行特异性的染色之后,将二者进行共孵育,16小时后收集细胞进行流式细胞术检测发现二者融合率超过50%。[结论]肿瘤细胞来源的微颗粒可以包裹和负载化疗药物,在体内和体外可以对肿瘤细胞进行强力的特异性杀伤,明显的抑制肿瘤形成。在杀伤肿瘤细胞的同时对其他的体细胞和免疫细胞影响较小,对机体不产生明显的副作用。本课题的研究对肿瘤细胞的化疗提供了新的途径。