大肠癌是人类最常见的恶性肿瘤之一。目前，大肠癌的治疗以手术为主，其他治疗为辅的原则，尽管近十几年来，术后生存率有所提高，但不十分明显，仍旧徘徊在50％(直肠癌)和70％(结肠癌)左右。除了需要提高早诊率、进一步改善治疗手段外，我们需要深入地了解大肠癌淋巴结转移的规律和机制，对大肠癌病人的淋巴结转移与否要有准确的判断，因为后者关系到手术方式的选择和术后治疗方案的制定。然而，现行的淋巴结转移分期(N分期)仅仅涉及了淋巴结转移与否及其绝对数目，忽视了其他淋巴结转移的相关参数，如转移度、转移范围、跳跃式转移等，而这些因素有可能影响病人的预后。因此，需要我们充分了解大肠癌淋巴结转移的各种参数的规律及其临床意义。 越来越多证据表明，大肠癌根治术后复发转移的原因之一是隐匿在淋巴系统中的肿瘤细胞，他们获得了逃逸机体免疫监视、抵御免疫细胞和因子攻击的能力，常规的手术切除“鞭长莫及”，化疗则难以在淋巴系统中长时间维持具有细胞毒性的药物浓度，给治疗带来困难，这可能可以部分解释淋巴结转移病人预后较差的原因。因此，需要寻找新的针对淋巴结转移的治疗手段，才可能提高这部分病人的生存率。而确实有效的治疗手段的发现需要对大肠癌淋巴结转移的机制有较透彻的了解。 近年来，随着组织胚胎学的发展，淋巴管内皮细胞标记物陆续被发现，为淋巴管的研究提供了有利的条件。通过研究，许多学者证明了肿瘤组织内部和瘤周组织存在新生淋巴管结构，可能是肿瘤细胞侵入淋巴系统的通道。迄今已在多种人类肿瘤包括大肠癌中观察到了淋巴管内皮细胞标记物VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3表达。有研究表明，它们在癌组织/癌旁组织的表达和淋巴管密度均与恶性肿瘤淋巴转移密切相关，是影响许多恶性肿瘤病人预后的因素。可见，肿瘤新生淋巴管的研究有希望揭示肿瘤淋巴道转移的机制，从而为淋巴靶向治疗手段的开发奠定基础。 因此，本课题从临床和基础两方面分别研究大肠癌淋巴结转移规律及其临床意义和探讨肿瘤新生淋巴管在大肠癌淋巴道转移中的可能机制。课题内容包括以下四个部分： 第1章：实验方法——实时定量PCR实时定量PCR是一种新的核酸定量技术。它在常规PCR基础上运用荧光能量传递技术，加入荧光标记，巧妙地把核酸扩增(PCR)、杂交、光谱分析和实时检测技术结合在一起，借助于荧光信号来检测PCR产物。目前，实时PCR技术检测扩增过程的技术包括非特异性双链DNA染色和特异性探针杂交系统。它的优点包括特异性、敏感性进一步提高，操作简便、快捷，结果准确，能有效避免污染及减少对人体的危害，减少工作量，更为重要的是它能精确定量，减少了系统偏倚，其结果说服力强。已被应用于病原体测定、免疫分析、肿瘤基因检测、基因表达、突变和多态性研究等多个领域。在肿瘤的定量研究中，可用于检测肿瘤细胞、进行癌基因定量、最小残留疾病研究以及判断疗效和预后等。 本研究使用的实时定量PCR检测系统为澳大利亚产的Rotor-gene2000，原理采用非特异性双链DNA染色。 第2章：大肠癌VEGFR-3与Prox1的相关性研究目的：探讨VEGFR-3和Prox1在大肠癌组织、正常黏膜组织和淋巴结中的表达及其相互关系。 方法：采用实时定量RT-PCR检测63份直肠癌肿瘤远端肠壁组织，156颗系膜淋巴结，各13份肿瘤组织和邻近正常黏膜组织中VEGFR-3、Proxl的mRNA含量。 结论：VEGFR-3与Proxl的表达在正常肠壁组织和系膜淋巴结中存在相关性，提示两者在新生淋巴管形成过程中可能有协同作用，并且在正常组织中是淋巴管内皮细胞良好的标记物。但在肿瘤组织中两者没有相关性，提示新生淋巴管在肿瘤组织内部和瘤周组织中的特征和作用机制不完全相同。 第3章：直肠癌淋巴管新生与肿瘤远端浸润的相关性研究目的：探讨直肠癌远端肠管组织新生淋巴管的长度及其对手术切除肠管范围的影响。 材料和方法：从10例直肠癌病人的手术切除标本中自肿瘤远端开始每隔0.5cm依次连续切取正常肠壁组织共63份，平均每例6.3份。运用实时定量RT-PCR检测VEGFR-3和Proxl的表达量。 结果：所有组织均表达VEGFR-3和Proxl。9例病人的VEGFR-3表达量和10例病人的Proxl表达量自近及远存在依次递减的趋势，大多数病例的VEGFR-3和Proxl表达量于癌旁1.5cm内出现明显落差。癌旁1.5cm内组织VEGFR-3表达量中位数高于癌旁＞1.5cm组织(P=0.024)。癌旁1.0cm内组织Proxl表达量中位数高于癌旁＞1.0cm组织(P=0.003)。 结论：新生的淋巴管可能为肿瘤细胞提供了转移的通道，成为他们侵入淋巴系统进行远处转移的桥梁。直肠癌远端肠管组织的新生淋巴管长度不超过3cm，大多数在1.5cm内，外科切除3cm远端肠管足以保证切除所有的新生淋巴管。 第4章：大肠癌淋巴结转移与淋巴管新生的相关性研究 一、临床部分大肠癌淋巴结转移规律的临床意义目的：探讨大肠癌淋巴结转移的规律及其与预后的关系。 方法：对1990年1月至1999年12月间有完整病理学检查和随访资料的1051例根治性切除的大肠癌病例进行回顾性分析。分析淋巴结转移率、转移度与临床病理参数的相关性。评价淋巴结活检数目、淋巴结转移度、转移范围和跳跃式转移对预后的影响。 结果：淋巴结转移率和转移度与性别、病程、肿瘤大小、多原发癌、合并肠息肉无关，与年龄、无症状呈负相关，与肿瘤部位、T分期、病理分级、大体类型、组织类型呈正相关。阳性家族史病例的淋巴结转移率和转移度较低。淋巴结活检数目、转移度和转移范围都是影响预后的因素。 结论：年龄越小、侵袭越深、分化越差、直肠癌、阳性家族史病例越容易发生淋巴结转移。淋巴结转移的临床指标能够影响预后。 二、基础部分大肠癌系膜淋巴结VEGFR-3和Proxl的表达与转移的关系目的：研究大肠癌系膜淋巴结转移与淋巴结内部淋巴管新生的相关性，探索新生淋巴管在肿瘤细胞远处转移过程中所起的作用。 材料和方法：运用实时定量RT-PCR法检测来自20例大肠癌病人手术切除标本的156枚系膜淋巴结的VEGFR-3和Proxl的表达情况。并运用传统RT-PCR法定性检测其中10例病人系膜淋巴结的CEA、CK-20、GCC的表达，了解微转移情况。比较病理组织学检查提示的淋巴结转移和VEGFR-3/Proxl的表达情况；分析淋巴结微转移与VEGFR-3/Proxl表达的关系。 结果：每例病人的阳性淋巴结组VEGFR-3和Proxl的表达量都比阴性淋巴结组低，存在统计学差异(P＜0.05)。10例病人中所发现的9枚微转移淋巴结的VEGFR-3/Prox1表达量介于病理检查阳性和阴性淋巴结组VEGFR-3/Proxl表达量之间。 结论：阳性淋巴结(包括病理形态学诊断和分子生物学诊断为微转移)的淋巴管内皮细胞标记物VEGFR-3和Proxl的表达均低于阴性淋巴结。新生淋巴管在肿瘤细胞淋巴道转移中的机制具有复杂的多种因子参与的特点，需要进一步深入的研究。 总结：1.VEGFR-3与Proxl的表达在正常肠壁组织和系膜淋巴结中存在相关性，提示两者在新生淋巴管形成过程中可能有协同作用，是淋巴管内皮细胞良好的标记物。但在肿瘤组织中两者没有相关性，提示新生淋巴管在肿瘤组织内部和瘤周组织中的特点和作用机制不完全相同。 2.新生的淋巴管可能为肿瘤细胞提供了转移的通道，成为他们侵入淋巴系统进行远处转移的桥梁。直肠癌远端肠管组织的新生淋巴管长度不超过3cm，大多数在1.5cm内，外科切除3cm远端肠管足以保证切除所有的新生淋巴管。 3.年龄越小、侵袭越深、分化越差、直肠癌、阳性家族史病例越容易发生淋巴结转移。淋巴结活检数目、转移度和转移范围都是影响预后的因素。 4.阳性淋巴结(包括病理形态学诊断和分子生物学诊断为微转移)的淋巴管内皮细胞标记物VEGFR-3和Proxl的表达均低于阴性淋巴结。提示新生淋巴管在肿瘤细胞淋巴道转移机制中作用的复杂性。 创新性：1.实验证明VEGFR-3和Proxl在正常组织中的表达具有相关性，在肿瘤组织中没有相关性。国内外文献未见相关报道。 2.检测直肠癌远端肠壁的VEGFR-3和Proxl的表达，提出直肠远端“新生淋巴管分子定界”的概念并探讨其临床意义。国内外文献未见相关报道。 3.提出淋巴结转移的高危因素，并建立数学模型；比较大肠癌淋巴结跳跃式转移与非跳跃式转移的预后差异。国内外文献未见相关报道。 4.检测恶性肿瘤淋巴结淋巴管内皮细胞标记物的表达情况，发现阳性淋巴结(包括病理形态学诊断和分子生物学诊断为微转移)的淋巴管内皮细胞标记物VEGFR-3和Proxl的表达均低于阴性淋巴结。国内外文献未见相关报道。 展望：新生淋巴管是近年来受到医学界广泛关注的活跃的研究领域。它有助于揭示肿瘤细胞微转移和微侵袭的机制，然而，许多问题尚需进一步研究。 新生淋巴管生长因子及其受体有可能成为抗癌药物新的靶点，在恶性肿瘤淋巴转移靶向治疗中发挥重要作用。