第一部分糖尿病大鼠皮肤组织学、胶原代谢及细胞生物学行为改变情况　　 目的:①观察糖尿病大鼠成模8周后皮肤的组织病理改变情况。　　 ②检测胶原代谢相关指标在糖尿大鼠皮肤局部的表达,评价糖尿病大鼠皮肤胶原合成与降解情况。　　 ③原代培养并观察糖尿病大鼠皮肤成纤维细胞和角质形成细胞增殖、迁移、粘附和胶原代谢等生物学行为变化。　　 研究方法:　　 1.糖尿病大鼠模型的建立清洁级雄性SD大鼠16只随机分为正常对照组(CON)和糖尿病组(DM)。糖尿病组按30mg/kg体重给予STZ连续3天腹腔内注射诱导糖尿病,注射后随机血糖水平≥16.7mmol/L,视为糖尿病模型制备成功。　　 2.血糖、体重检测造模开始前以及成模后每周测血糖和体重。尾静脉采血后采用强生One-Touch血糖仪检测随机血糖水平。　　 3.标本的留取鼠背正中从颅骨后1cm到5cm处取皮肤标本,除用于原代培养外,余下组织标本部分液氮保存,部分4％多聚甲醛固定,部分3％戊二醇固定。　　 4.HE染色观察皮肤组织形态　　 5.Masson三色染色法评价皮肽胶原纤维含量　　 6.天狼星红-苦味酸染色,偏振光显微镜下观察评价Ⅰ、Ⅲ型胶原比例　　 7.透射电镜观察皮肤组织超微结构　　 8.RT-PCR检测大鼠皮肤组织中CollⅠ、CollⅢ、TGF-β、MMP-1以及TMP-1mRNA表达水平　　 9.免疫印迹法(Western bloting)检测检测皮肤组织中MMP—1、TIMP-1蛋白水平　　 10.酶联免疫吸附实验(ELISA)检测皮肤组织中TGF-β、PICP、ICTP以及PIIINP的浓度　　 11.原代大鼠皮肤成纤维细胞的分离、培养与鉴定12.大鼠皮肤成纤维细胞增殖能力检测　　 12.1 MTT法绘制皮肤成纤维细胞生长曲线12.2细胞计数法计算细胞倍增时间13.大鼠皮肤成纤维细胞迁移能力检测　　 13.1 Transwell法评价皮肤成纤维细胞迁移能力13.2划痕试验评价皮肤成纤维细胞迁移能力　　 14.大鼠皮肤成纤维细胞胶原合成及代谢情况检测　　 15.原代大鼠皮肤角质形成细胞的分离、培养与鉴定16.大鼠皮肤角质形成细胞增殖能力检测　　 16.1克隆形成实验评价角质形成细胞增殖能力16.2流式细胞仪检测角质形成细胞细胞周期　　 17.大鼠皮肤原代角质形成细胞粘附能力检测　　 第一部分结论:　　 糖尿病大鼠皮肤组织发生一系列病理性变化,这种变化可能与局部胶原合成与降解不平衡以及细胞生物学行为的改变有关。这可能构成了糖尿病皮肤易损伤和溃疡难愈合的病理基础。　　 第二部分糖尿病大鼠皮肤RAS系统表达情况　　 目的:①检测RAS系统各组成成分包括血管紧张素原(AGT)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1)、血管紧张素Ⅱ2型受体(AT2)、血管紧张素转化酶1(ACE1)、血管紧张素转化酶2(ACE2)等在正常对照和糖尿病大鼠皮肤局部的表达情况。　　 ②检测AngⅡ、AT1受体、AT2受体在大鼠皮肤成纤维细胞的表达。　　 研究方法:　　 1.糖尿病大鼠模型的建立(同第一部分)。　　 2.标本的留取(同第一部分)。　　 3.免疫组织化学染色观察皮肤血管紧张素Ⅱ、AT1受体和AT2受体的表达及定位。　　 4.RT-PCR法检测大鼠皮肤组织中AGT、AT1受体、AT2受体、ACE1以及ACE2 mRNA表达。　　 5.免疫印迹法(Western bloting)检测检测皮肤组织中AT1受体、AT2受体蛋白水平。　　 6.放射免疫法(RIA)检测皮肤组织局部AngⅡ含量。　　 7.皮肤成纤维细胞RAS系统表达情况。　　 7.1 RT-PCR检测大鼠皮肤成纤维细胞中AT1受体、AT2受体mRNA表达。　　 7.2免疫印迹法检测大鼠皮肤成纤维细胞中AT1受体、AT2受体蛋白表达。　　 7.3放射免疫法检测培养基上清AngⅡ含量。　　 第二部分结论:　　 正常大鼠皮肤和糖尿病大鼠皮肤均能表达RAS系统的组分,属于组织RAS系统；糖尿病大鼠皮肤组织AngⅡ浓度明显高于正常对照组,AT1受体mRNA和蛋白表达增加,AT1/AT2受体的比值明显增加,提示糖尿病大鼠皮肤组织RAS系统处于激活状态。体外培养的大鼠皮肤成纤维细胞也能表达RAS系统的组分,且糖尿病大鼠皮肤成纤维细胞分泌AngⅡ水平升高,AT1受体表达增加,AT2受体表达减少。　　 第三部分血管紧张素Ⅱ对糖尿病大鼠成纤维细胞胶原代谢的影响及机制初探　　 目的:探讨AngⅡ、AT1受体拮抗剂Losartan和AT2受体拮抗剂PD123319对体外培养的正常和糖尿病大鼠皮肤成纤维细胞胶原合成和分解的影响。　　 研究方法:　　 1细胞培养及处理成纤维细胞的培养方法同第一部分。正常和糖尿病成纤维细胞分别分为以下四组:A,对照组:0.5％胎牛血清的DMEM培养液。B,AngⅡ组:培养液中加入浓度10-7mol/L AngⅡ。C,AngⅡ+Losarta组:培养液中先加入Losartan10-5mol/L预处理30min,再加入10-7mol/L AngⅡ。D,AngⅡ+PD123319组:培养液中先加入PD12331910-5mol/L预处理30min,再加入10-7mol/L AngⅡ。24小时后收集细胞和培养上清液,进行下一步实验。　　 2 RT-PCR检测四组成纤维细胞的TGF—β、MMP-1、TIMP-1、CollⅠ、CollⅢmRNA表达。　　 3免疫印迹法(Western bloting)检测检测四组成纤维细胞MMP-1、TIMP—1蛋白表达。　　 4酶联免疫吸附剂测定(ELISA)检测四组成纤维细胞培养基上清TGF-β、PICP、ICTP、PIIINP的浓度。　　 第三部分结论:AngⅡ通过AT1受体增加TGF—β表达,上调TIMP—1、PICP、ICTP、PIIINP的水平,在调节皮肤成纤维细胞胶原合成和降解中发挥着重要作用。