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目的:组织定居记忆T细胞(Tissue-resident memory T cells,TRM)是记忆T细胞的新亚群,初始T细胞在抗原激活后会迁移到多种外周非淋巴组织器官,在原位分化成特异性的记忆T细胞,而定居下来,不再经过淋巴细胞再循环,当在该组织中遇到相同抗原时能迅速发生应答,在保护性免疫作用中独立于循环记忆T细胞。目前在皮肤、肺、阴道粘膜、大脑,甚至在淋巴组织中都已发现了TRM的存在,其中CD8+TRM细胞的表型为:CD69+CD103+,CD4+TRM细胞的表型为:CD69+CD11a+。过敏性哮喘是一种常见的、复杂的、多基因调控的慢性呼吸系统疾病,其特征是慢性的气道炎症以及非特异性的气道高反应。过敏性哮喘的炎症应答由多种炎症细胞(如嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和气道上皮细胞等)和炎症因子共同参与,其临床表现为反复发作的喘息、气急、胸闷、咳嗽等症状。目前,全世界将近3亿人口患有过敏性哮喘,中国就有约3000万患者,且其发病率仍然在以每十年近50%的速度增加,严重危害人们的健康。过敏性哮喘属于再次免疫应答的范畴,过敏原诱导免疫应答并形成特异性的TRM细胞,在肺中长期存在;当过敏原再次进入呼吸道后迅速激活肺TRM细胞,TRM细胞可能在过敏性哮喘的发病机制中扮演重要角色。本实验利用过敏性哮喘的小鼠模型,研究了肺TRM细胞在过敏性哮喘发生发展中的作用。方法:1建立过敏性哮喘小鼠模型1.1小鼠的致敏和激发取雌性6周龄BALB/c小鼠,随机分为以下2组:正常对照组,哮喘模型组。哮喘模型组:每只小鼠分别于实验开始0天和14天腹腔注射0.02%OVA致敏液200μl。于实验开始第35天(第二次致敏三周后),腹腔注射1%戊巴比妥钠(50mg/kg),每只约100-120μl,待麻醉后,鼻腔吸入0.4%OVA激发液50μl,连续5天。正常对照组:用PBS缓冲液代替致敏液和激发液,方法同模型组。1.2血清Ig E检测:分别于末次致敏后三周和末次激发后24小时摘眼球取血,分离血清,用ELISA检测OVA特异性抗体Ig E水平。1.3气道高反应性检测肺气道阻力和动态肺顺应性。1.4处死小鼠,取肺组织做病理切片,HE染色,观察炎症浸润情况;PAS染色,观察气道粘液分泌情况;1.5收集支气管肺泡灌洗液和肺匀浆液:ELISA检测上清中细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17、IL-1β、MCP-1、MIP-1α的含量;1.6取支气管肺泡灌洗液中的细胞,瑞氏-吉姆萨染色分类计数炎性细胞;1.7实时定量PCR检测肺组织中IL-5、IL-10、IL-13、IFN-γ、IL-1β、MCP-1、MIP-1α、RANTES、Eotaxin、GRO-α的m RNA表达。2分析致敏小鼠肺TRM细胞分组和致敏方案同1.1,小鼠末次致敏三周后,处死小鼠,流式细胞仪分别检测其肺和脾记忆T细胞的数量。3过继转移记忆细胞,或用阻断剂抑制肺TRM细胞形成,分析肺TRM细胞在过敏性哮喘中的作用。3.1取雌性6周龄BALB/c小鼠,随机分为以下5组。分组如下:肺单个核细胞过继转移组:致敏方案同1.1哮喘模型组,于实验开始第35天(第二次致敏三周后),取肺单个核细胞每两只合并分别尾静脉注射到一只正常小鼠体内。过继转移小鼠于注射一周后每只腹腔注射1%戊巴比妥钠(50mg/kg),每只约100-120μl,待麻醉后,鼻腔吸入0.4%OVA激发液50μl,连续5天。肺记忆细胞过继转移组:致敏方案同1.1哮喘模型组,于实验开始第35天(第二次致敏三周后),取肺记忆细胞(TRM),余下操作同肺单个核细胞转移组。脾记忆细胞过继转移组:致敏方案同1.1哮喘模型组,于实验开始第35天(第二次致敏三周后),取脾记忆细胞,余下操作同肺单个核细胞转移组。仅激发组:正常饲养,至过继转移组注射一周后余下操作同肺单个核细胞转移组。加抑制剂组:每只小鼠分别于实验开始0天和14天腹腔注射0.02%OVA致敏液200μl,同时给予(腹腔注射)FTY720免疫抑制剂稀释液10μl(每只小鼠100μg即按0.1mg/kg)。后续激发方案同1.1哮喘模型组。3.2检测分析同1.3-1.7检测。结果:1成功建立了小鼠哮喘模型1.1 Ig E:对照组无Ig E,哮喘模型组小鼠血清中OVA特异性Ig E效价显著高于对照组(P<0.01)。1.2小鼠肺组织病理变化:HE染色可见对照组小鼠肺泡壁结构完整,肺泡周围仅有少量炎性细胞,支气管壁平滑无增厚;哮喘模型组,肺组织被破坏,肺泡和支气管周围可见大量炎性细胞浸润,支气管壁增厚,管腔变窄;PAS染色可见对照组支气管内壁无粘液分泌,哮型模型组支气管内壁可见大量的粘液分泌。1.3气道高反应性:哮喘模型组较对照组气道阻力(RI)显著升高,肺动态顺应性(Cdyn)显著降低。2 OVA致敏诱导了TRM的产生:与对照组相比,致敏组肺组织中TRM细胞和脾细胞中TCM细胞的数量显著升高(P<0.01)。3过继转移细胞组和加抑制剂组各项检测结果3.1 Ig E:与对照组相比,哮喘模型组,致敏组,加抑制剂组Ig E效价显著升高(P<0.01),但三组间没有明显差异;肺记忆细胞过继转移组、肺单个核细胞过继转移组、脾记忆细胞过继转移组、仅激发组,与对照组相比也有差异(P<0.05),组间无差异。3.2气道高反应性:结果显示肺记忆细胞过继转移组在Mch浓度达到最高剂量时较对照组气道阻力(RI)显著升高(P<0.05),但显著低于肺单个核细胞过继转移组;肺单个核细胞过继转移组与对照组相比在Mch各个浓度气道阻力(RI)都显著升高;加抑制剂组在Mch低剂量时较哮喘模型组气道阻力(RI)显著降低(P<0.01),在高剂量时无明显差异。3.3小鼠肺组织病理变化3.3.1 HE染色可见:与对照组相比,肺单个核细胞过继转移组、肺记忆细胞过继转移组肺组织中炎性细胞浸润不多,肺泡也比较完整,但支气管壁增厚,尤其肺单个核细胞过继转移组增厚更加明显;加抑制剂组较哮喘模型组炎性细胞浸润多集中在支气管周围,且支气管壁增厚严重;仅激发组、脾记忆细胞过继转移组较对照组无明显变化。3.3.2 PAS染色可见:肺单个核细胞过继转移组、肺记忆细胞过继转移组与对照组相比,支气管壁增厚,且都有轻微粘液分泌;加抑制剂组支气管内壁增厚可见大量的粘液分泌,较哮喘模型组差别不明显;仅激发组和脾记忆细胞过继转移组支气管内壁无粘液分泌。提示肺TRM细胞参与了气道粘液的产生,但不是唯一因素。3.4瑞氏-吉姆萨染色后小鼠支气管肺泡灌洗液细胞分类计数结果显示:哮喘模型组和加抑制剂组与对照组相比总的白细胞数、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞百分率都显著升高(P<0.01),巨噬细胞百分率显著降低(P<0.01);加抑制剂组的嗜酸性粒细胞百分率显著高于哮喘模型组(P<0.05),而淋巴细胞百分率显著低于哮喘模型组(P<0.05);肺单个核细胞过继转移组与对照组比,白细胞总数、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞百分率显著升高(P<0.05),巨噬细胞百分率显著降低。3.5 ELISA夹心法检测支气管肺泡灌洗液上清和肺匀浆液上清中细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17、IL-1β、MCP-1、MIP-1α的含量。结果显示:哮喘模型组和加抑制剂组与对照组相比Th2型细胞因子IL-4、促炎因子IL-1β、趋化因子MCP-1、MIP-1α含量显著升高(P<0.05);加抑制剂组IL-4、MCP-1的含量更显著高于哮喘模型组(P<0.05);而哮喘模型组Th1型细胞因子IFN-γ的含量显著高于对照组,加抑制剂组则显著低于哮喘模型组(P<0.05)。肺单个核细胞过继转移组和肺记忆细胞过继转移组与对照组相比在支气管肺泡灌洗液上清中MCP-1的含量显著升高(P<0.05),其余细胞因子无明显变化。在肺匀浆液上清中,加抑制剂组IL-1β的含量比哮喘模型组显著降低(P<0.05)。3.6 RT-PCR检测肺组织中IL-5、IL-10、IL-13、IFN-γ、IL-1β、MCP-1、MIP-1α、RANTES、Eotaxin、GRO-α的m RNA表达。结果显示:哮喘模型组和加抑制剂组与对照组相比Th2型细胞因子IL-5、IL-10、IL-13、促炎因子IL-1β、趋化因子MCP-1、MIP-1α、RANTES、Eotaxin、GRO-α的m RNA表达量显著升高(P<0.05),且加抑制剂组IL-5、IL-10、IL-13、MCP-1、RANTES、Eotaxin、GRO-α的m RNA表达量显著高于哮喘模型组(P<0.05);哮喘模型组与对照组相比Th1型细胞因子IFN-γm RNA表达量显著升高(P<0.05),而加抑制剂组、肺单个核细胞过继转移组、肺记忆细胞过继转移组、脾记忆细胞过继转移组、仅激发组与对照组相比表达量都显著降低(P<0.05);过继转移各组其他的细胞因子表达量与对照组相比无明显变化。提示TRM细胞影响了Th1和Th2型细胞的平衡。结论:1成功建立了OVA诱导的小鼠过敏性哮喘的模型。2在模型小鼠肺组织中存在TRM细胞。3肺TRM细胞参与了过敏性哮喘小鼠的气道高反应性的发生,但并非唯一的细胞,肺其它的单个核细胞也发挥着重要作用。4 TRM细胞在过敏性哮喘中,影响了Th1和Th2型细胞的平衡,TRM细胞的减少使Th2型优势应答更为明显,使肺部和气道内的炎性细胞因子更高。