目的：　　 胰腺癌是一种难治性疾病，而且发病率有持续升高的趋势。由于胰腺癌部位特殊，早期病例多无临床症状，80％-90％的胰腺癌病人就诊时已经处于晚期，手术切除率只有15％，五年生存率1％-5％。然而早期胰腺痛的手术切除率为90％-100％，五年生存率可达70％-100％。因此，早期诊断和治疗胰腺癌可以显著提高病人生存率，明显改善预后。近年来随着基础医学研究的逐渐深入，应用细胞学和分子生物学技术成为了肿瘤研究的热点，目前多集中在胰腺癌相关的肿瘤标志物的分子生物学研究，若能通过分子生物学的方法寻找对胰腺癌既高度敏感又高度特异的肿瘤标记物，将使胰腺癌的早期诊断和特异性的靶向治疗成为可能。SELEX技术的出现则为肿瘤标志物的寻找带来了新的思路。指数富集的配体系统进化技术，简称SELEX（Systematic Evolution of Ligands by ponential Enrichment）技术，它是一种新的高通量生物文库筛选技术，应用大容量的随机寡核苷酸文库（ssDNA文库和RNA文库），结合PCR体外扩增技术，以指数级富集与靶分子特异结合的寡核苷酸，经过反复的体外筛选、扩增，最终获得的寡核苷酸适体(aptamer)。基于形成的空间结构与靶分子呈高特异性和高亲和力的结合，又由于aptamer具有精确识别、无免疫原性、易体外合成与修饰等优点，在基础医学、临床诊断与新药研发等方面具有广阔的应用前景。尤其是近年来兴起的复合靶SELEX技术，使得对未知靶分子进行筛选成为可能，并且通过引入消减筛选步骤，能够获得特异识别两类复合靶分子上差异存在的aptamer，并能利用该配基反过来对靶分子进行研究，这就为开发新型分子探针以及鉴定生物标志物开辟了新的途径。本研究主要围绕消减SELEX展开，利用SELEX方法筛选出对胰腺癌细胞具有高度诊断特异性的寡核苷酸适配子，从而为胰腺癌的早期诊断和特异性的靶向治疗提供实验基础。　　 实验材料与方法：　　 一、实验材料　　 1、随机单链寡核苷酸文库及其相关引物。　　 2、筛选的细胞株及细胞培养的相关试剂。　　 3、PCR及电泳的相关试剂。　　 4、细胞消减SELEX筛选的相关试剂。　　 5、流式细胞术与荧光显微镜检测的相关试剂。　　 二、实验方法　　 1、确立消减筛选的两种细胞株及建立随机单链寡核苷酸文库与相关引物的设计。　　 2、运用消减SELEX技术进行数轮的筛选获得富集文库。　　 3、确定特殊茎环引物PCR制备次级文库的最佳循环数及文库模板量。　　 4、采用特殊茎环引物PCR的方法对次级文库进行制备。　　 5、采用流式细胞术与荧光显微镜这两种方法分别对文库富集的情况进行监测。　　 结果：　　 在细胞消减SELEX过程中，我们从第四轮开始加入了消减细胞共进行了七轮的筛选。同时我们采用特殊茎环引物PCR法对次级文库进行制备。在非对称PCR的过程中我们发现36个循环数时目的条带产量大且杂带少，以此循环数作为最适循环数进行PCR扩增，另外，文库（模板）量适当增加有助于增大目的条带的产量且使非特异性的产物明显减少。特殊茎环引物PCR的扩增效率可指示富集情况，我们在对文库富集情况进行监测时首先采用变性PAGE凝胶电泳，发现随着筛选轮次递增，目的条带出现递减趋势。同时采用流式细胞术进行鉴定出现同样结果，随着筛选进行荧光强度增强，图形右移越明显。荧光显微镜观察结果也一致。说明特异识别胰腺癌细胞BxPC-3的适配子正逐渐得到富集。　　 结论：　　 1、采用特殊茎环引物PCR法对次级文库进行制备我们确定了36个循环数为最佳循环数，且适当增加文库（模板）量有助于增大目的条带的产量且使非特异性的产物明显减少。　　 2、我们在对文库富集情况进行监测时无论是采用变性PAGE凝胶电泳还是采用流式细胞术以及荧光显微镜观察均提示特异识别胰腺癌细胞BxPC-3的适配子正逐渐得到富集。