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脊椎动物骨骼的生长发育主要是靠膜内骨化和软骨内骨化完成的。其中,软骨内骨化主要发生在四肢骨和躯干骨等大部分骨骼元件中,是骨的发育和生长阶段中一个关键的生理过程。该过程起始于间充质干细胞的凝集并分化形成软骨细胞,随后,软骨细胞经过增殖、成熟、肥大化的分化步骤分化为肥大化的软骨细胞,再经历细胞凋亡、钙化、血管入侵,破骨细胞和造骨细胞产生等一系列过程,最终以退化的软骨基质为构架产生骨基质。在某种情况下,软骨细胞肥大化进程发生异常,将发生由软骨降解和结构破坏、软骨发育异常等原因引起的相关疾病,如,骨关节炎以及软骨发育不全等。因此,深入研究软骨细胞肥大化分子机制,对于软骨细胞肥大化相关疾病的预防和治疗具有重要意义。随着micro RNAs(mi RNAs)在脊椎动物软骨发育中的作用被发现和报道,在软骨分化过程中的相关mi RNAs功能研究成为了骨关节炎与骨骼发育病理研究的一大热点。本文旨在探究micro RNA-27b(mi R-27b)在软骨细胞肥大化过程中的作用,并分析其通过靶基因之一过氧化物酶增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)在软骨细胞肥大化过程中的调控机制。本研究以出生1-3天的大鼠乳鼠膝关节软骨为研究对象,用免疫组化、RT-PCR的方法观察正常软骨细胞标志物II型胶原(COL II)以及肥大化标志物X型胶原(COL X)、MMP-13的表达情况以确定膝关节软骨的静止区、增殖区和肥大化区,用原位杂交实验以及RT-q PCR检测mi R-27b的分布情况。结合生物信息学网站、双荧光素酶报告基因实验系统以及Western blot确定PPAR-γ为其靶基因之一。并在此基础上进行mi R-27b过表达实验,分为实验组(mi R-27b mimic)、阴性对照组(negative control)、和转染试剂对照组(normal),分别从基因和蛋白水平证实mi R-27b对软骨细胞肥大化的抑制作用。结果:1.形态学染色结果显示,软骨细胞柱状排列,由关节表层至深层,体积逐渐增大,COL X表达增加。2.原位杂交结果显示,mi R-27b主要表达在细胞核中,随着软骨细胞肥大化分化,其表达量逐渐下降。RT-q PCR结果显示,与肥大化期软骨细胞相比,静止期软骨细胞mi R-27b的表达高至6.2倍(P<0.01)。3.通过生物信息学网站分析,确认PPAR-γ3’-UTR序列上存在mi R-27b的结合位点;双荧光素酶报告基因实验证实,在软骨细胞中rno-mir-27b-3p对psi CHECK-PPAR-γ(p<0.01)的荧光表达有显著抑制作用。Western blot结果显示,mi R-27b mimic转染组,PPAR-γ2表达明显下调。4.分离培养肥大化软骨细胞,并对其进行过表达干预,同时用软骨细胞肥大化诱导液继续肥大化诱导。7天后,实验组与对照组均有油红O染色阳性的脂滴出现,实验组与转染试剂对照组和阴性对照组相比,脂滴数量明显降低(P<0.01)。5.RT-q PCR结果显示,mi R-27b过表达以后,COL II、SOX-9表达增加(P<0.01),MMP-13、PPAR-γ表达下降(P<0.01);Western blot结果显示,mi R-27b过表达以后,PPAR-γ2与COL X的蛋白表达明显受到抑制。结论:1.Mi R-27b对软骨细胞肥大化发挥负调控作用。2.提高mi R-27b的表达可以推迟软骨细胞肥大化进程。3.PPAR-γ是mi R-27b的靶基因之一,它可能通过某种机制正调控COL X的表达。