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丝状真菌具有原料要求低、良好的转录后修饰和高分泌能力等一系列优点,在工业生产中被广泛应用,是一类很好的蛋白表达宿主。但目前所报道的丝状真菌蛋白表达系统仍然存在宿主分泌背景较高或靶标蛋白分泌效率较低等缺点。草酸青霉野生菌株是我国具有自主知识产权的木质纤维素降解酶产生菌,具有高分泌能力以及非诱导条件下的低分泌背景等特点。以草酸青霉为研究对象,通过基因工程手段重构淀粉酶表达调控途径,构建了一个高效表达目的蛋白并且背景蛋白很低的丝状真菌蛋白表达系统。本文的主要的研究内容和研究结果如下:一.重构淀粉酶表达调控途径通过敲除淀粉酶基因amy13A以及碳源优化来提高草酸青霉蛋白分泌能力同时降低背景蛋白分泌量。利用来自构巢曲霉的pyrG基因作为筛选标记,从尿嘧啶缺陷型菌株DB2出发,利用原生质体转化的方式将amy13A敲除盒导入出发菌株,获得转化子Δ13A,Δ13A中淀粉酶Amy13A的敲除使得分泌背景得到降低。比较了葡萄糖和淀粉两种碳源对草酸青霉淀粉酶表达的促进效果,确定了淀粉比葡萄糖对淀粉酶启动子Pamy15A的激发效率更好,更适合作为蛋白表达的碳源。二.蛋白表达系统的构建过表达淀粉酶转录激活因子amyR来提高启动子Pamy15A的效率。从尿嘧啶缺陷型菌株DB2出发,利用amy13A的启动子和筛选标记pyrG,用amy R的编码区构建了过表达敲除盒,通过原生质体转化获得工程菌株Δ13A-OamyR。在Δ13A-OamyR菌株中amyR基因的表达得到进一步提高。过表达amyR后,明显提高了启动子Pamy15A的启动效率。三.蛋白表达系统的进一步优化敲除CreA进一步提高启动子Pamy15A的效率。结合β-rec/six标记回收系统,利用纤维素进行诱导,去除了Δ13A-OamyR菌株的筛选标记pyrG后,将creA敲除盒通过原生质体转化的方式导入,实现对creA的敲除。得到的转化子Δ13A-OamyR-ΔCreA相比较于出发菌株Δ13A-OamyR,在淀粉作为唯一碳源进行发酵时淀粉酶活和胞外蛋白浓度有了显著的提高,启动子Pamy15A的启动效率得到进一步增强。