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恶性黑色素瘤(malignant melanoma, MM)是来源于黑色素细胞的一种恶性肿瘤。在过去的20多年中,世界范围内恶性黑色素瘤的发病率呈逐步增高的趋势。皮肤是恶性黑素色瘤的主要发病部位,占皮肤恶性肿瘤的死亡率约70%,也可起源于眼、鼻腔等处,其高度侵袭与转移的能力是恶性黑色素瘤患者死亡的主要原因,早期可转移至肺、脑等部位,晚期随体循环扩散至全身。而上皮-间充质转换(epithelialmesenchymal transition, EMT)在其中扮演着重要角色,EMT被认为是启动肿瘤侵袭转移的重要事件。研究表明,历经EMT的恶性黑色素瘤细胞能从肿瘤的原发灶逃离,侵袭到周围其他组织,经过血液或淋巴途径到达更远处的器官形成转移灶。新近研究还发现,有EMT表型的恶性黑色素瘤细胞更具耐药性、免疫抑制及类干细胞等特性。在EMT的发生发展过程中最主要的调控对象是E-钙黏着蛋白(E-cadherin)。该蛋白是维持上皮细胞特性的重要分子,E-cadherin的丢失是EMT的一个重要特征,若E-cadherin表达下降,细胞则会呈现许出多非上皮细胞的特征,如细胞极性丢失,细胞间的粘附性降低,转变成更易发生转移的间质细胞,而表达波形蛋白(Vimentin)上调,这些蛋白表达改变是EMT的一个重要标志。因此,探究EMT的发生和调控机制,对于寻找治疗肿瘤细胞转移的靶点有重要意义。随着分子生物学的发展,研究者发现肿瘤组织中有极少数细胞具有类干细胞的特性：能无限增殖、不断分化,对化疗、放疗不敏感,而这些细胞成为肿瘤发生、侵袭转移和复发的关键细胞,即肿瘤干细胞(tumor stem cells, TSCs)或癌干细胞(cancer stem cells, CSCs)。近来对肿瘤发生发展过程的研究表明,锌指结合蛋白(1 zinc finger E-box-binding protein 1, ZEB1)在肿瘤转移过程中发挥着重要作用。ZEB1是锌指结构转录因子中的E盒结合锌指蛋白,它不仅能调节EMT的发生和发展,还能通过调节细胞周期、细胞凋亡、衰老、侵袭转移和间质血管生成等,进而调节肿瘤的进展。本课题组前期实验结果显示：降低B16F10细胞中ZEB1的表达,可在一定程度上降低B16F10细胞在体外的克隆形成能力、增殖能力、耐药性、侵袭转移能力及体内致瘤能力,但对B16F10细胞中CSCs的影响如何,期待进一步探讨。正因如此,本研究选择小鼠黑色素瘤细胞系B16F10细胞中CD133+ CD44+CSCs作为研究对象,将其从B16F10细胞中分离,探讨下调ZEB1的表达对CD44+CD133+CSCs的致瘤性和肺转移的影响,从而为恶性黑色素瘤的治疗提供新的思路。目的：探讨下调黑色素瘤CSCs中ZEB1的表达对其致瘤性和肺转移的影响,为寻找黑色素瘤新的治疗靶点提供实验依据。方法：1.将构建好的靶向鼠ZEB1基因的pSUPER-EGFP1-ZEB1-shRNA干扰质粒通过脂质体转染B16F10细胞,并通过G418筛选稳定转染细胞株。2.用免疫磁选技术从稳定转染pSUPER-EGFPl-ZEB1-shRNA的B16F10克隆中分离获取ZEB1-shRNA2CD 133+CD44+CSCs以及scramble-shRNA CD133+ CD44+CSCs;从B16F10细胞中分选出CD133+CD44+CSCs。3.通过划痕实验、侵袭性实验,体内致瘤性、荷瘤鼠生存实验及肺转移实验,综合分析下调ZEB1表达后对B16F10 CD44+CD133+ CSCs的致瘤性和肺转移的影响。4.用2×104B16F10 CD44+CD133+CSCs、ZEB1-shRNA CD44+CD133+CSCs、 scramble-pSUPER-EGFP CD44+CD133+CSCs分别攻击C57BL/6小鼠,通Western Blotting实验和免疫组化实验分别检测瘤组织中EMT相关蛋白ZEB1, E-cadherin N-cadherin及Vimentin的表达。结果：1.分离出经G418筛选出稳定转染pSUPER-EGFP1-ZEB1-shRNA的B16F10细胞克隆；2.用免疫磁选技术成功分离出ZEB1-shRNA CD133+CD44+CSCs、scramble-pSUPER-EGFP CD133+CD44+CSCs以及B16F10 CD133+CD44+CSCs;划痕实验、侵袭性实验、小鼠体内致瘤性和肺转移实验结果显示：B16F10 CD44+CD133+ CSCs及scramble-pSUPER-EGFP CD44+CD133+CSCs的侵袭性和转移性以及致瘤性均高于ZEB1-shRNA CD44+CD133+CSCs,差异有显著性意义(P<0.01)3. qRT-PCR法、Western Blotting及免疫组化检测瘤组织中EMT相关蛋白显示：ZEB1-shRNA CD44+CD133+CSCs的靶基因ZEB1表达减低,间质型蛋白Vimentin和N-cadherin表达下降,而上皮型蛋白E-cadherin的表达升高；肺组织黑色素瘤转移结节显著减少,与B16F10 CD44+CD133+CSCs和scramble-pSUPER-EGFP CD44+CD133+CSCs组相比,差异有显著性意义(P<0.05或P<0.01)。结论：下调黑色素瘤B16F10 CD44+CD133+CSCs中ZEB1的表达,可在一定程度上降低其在体外的增殖能力、克隆形成能力,侵袭力及小鼠体内致瘤性和抑制肺转移能力,提示ZEB1可作为黑素瘤CSCs治疗的新靶点。