研究背景及目的前列腺癌作为威胁男性健康最常见肿瘤之一,其发病率在发达国家高居男性肿瘤首位,占全部恶性肿瘤的28%,死亡率仅次于肺癌。2008年全世界范围内前列腺癌新发病例约899000例,死亡病例约258000例,其中72%的新发病例和53%的死亡病例均发生于欧洲、北美等发达国家。在世界范围内亚洲地区的前列腺癌发病率是最低的,但是近年来也有明显上升趋势。中国前列腺癌的发病率与死亡率虽远低于欧美发达国家,但近年来随着人口老龄化、环境污染和生活条件的改善,发病率呈迅速上升趋势,早已成为影响男性健康的主要因素。不断上升的发病率使前列腺癌的研究越来越受到关注重视。1941年,Huggins等首次阐述了通过切除睾丸去除雄激素能够抑制前列腺的生长,并且能够在转移前列腺癌患者身上产生戏剧化的主观和客观的效果。这一发现为前列腺癌的治疗揭开了新篇章,也是对激素依赖性癌症治疗的重大突破。从此内分泌治疗在前列腺癌治疗中占据经久不衰的重要地位。随着去雄激素治疗这一概念的提出,在20世纪50年代有许多雌激素治疗前列腺癌的报道。然而,内分泌治疗平均1.5年-2年的时间,几乎所有的患者的病变都会逐渐进展为激素非依赖性前列腺癌或者激素难治性前列腺癌,将不能再凭借激素来治疗。而对于激素非依赖性前列腺癌,当前还没有标准且有效的治疗方案,最后导致病情恶化,治疗失败。到现在为止,前列腺癌发生雄激素非依赖性改变的机制还没有完全清楚。近些年来,不论在基础还是在临床研究中,对于前列腺癌的治疗方法的研究成为一个活跃的领域。肿瘤是一类多基因疾病,细胞基因组完整性的改变是肿瘤发生的物质基础。细胞周期的监控机制是细胞基因组完整性的重要保证,如果监控机制发生破坏,则导致细胞遗传的不稳定性,染色体发生重排,如基因缺失、扩增和及移位等,当突变基因的累积破坏了细胞周期的驱动机制,将导致细胞发生失控性生长,最后导致癌变。细胞分裂周期的调控是一个复杂的生物学过程,这一过程涉及到几乎全部的癌基因、抑癌基因的生物学效应。许多癌基因、抑癌基因直接参与细胞周期的调控,或者本身就是细胞周期调控复合体的主要成分。这些基因变异的结果,造成了细胞周期的失控,失去控制的细胞将无限制增殖,形成的克隆群体便是肿瘤。因此,有学者指出肿瘤是一类细胞周期疾病。慢病毒载体(lentiviral vector,LV)作为一类来源于逆转录病毒的载体,以其转染效率高,可感染分裂期和非分裂期细胞,可容纳较大的基因片段等优点,在科研领域有着良好的发展前景。RNA干扰(RNA interference,RNAi)其机制是通过抑制特定基因的转录或翻译来抑制基因表达。将与内源性mRNA编码区同源的双链RNA导人细胞中,双链RNA先降解为小干扰RNA(Small interfering RNA,即siRNA),随后siRNA与一些蛋白合成RNA诱导沉默复合体(RNA—inducedsilencing complex,RISC),引发靶mRNA降解而导致基因表达沉默。将慢病毒载体作为RNAi技术的载体,可以结合两者优势特异性抑制哺乳动物的各类细胞中基因的表达,成为基因功能研究和基因治疗的有力手段。因此近年来RNAi技术和慢病毒载体技术的发展已为前列腺癌治疗的研究提供了一种新思路。肿瘤的发生是一个多步骤的过程,在多因素(包括环境因素和遗传因素)作用下,导致原癌基因的激活和抑癌基因功能的丧失.在肿瘤细胞的恶性进展过程中,随着基因突变的积累,导致其逃避正常的细胞分裂调控机制、细胞凋亡能力下降、向周围组织入侵和远处转移的能力增加。调节细胞周期进行、凋亡及转移的机制非常复杂,已知有大量蛋白质分子参与了这些过程。最近,韩赵东等应用双向电泳及质谱分析的方法鉴定出2566种肿瘤蛋白,并通过生物信息学分析出有60个差异性蛋白在前列腺癌中,其中表达为上调的有37个,而表达为下调的则有23个。而其中有14种基因及其蛋白产物(ACLY,CAPG,GSTM3,GSTP1,HNRNPL,IMPDH2,KRT15,MCCC2,MSN,MYL9,PYGB,SERPINB5,TRAP1 and VCL)在前列腺癌中表达具有明显的差异。在真核生物细胞中,由基因组DNA通过转录直接生成的RNA由于其随机分布在核内,且长短不一,故被称作核内不均一性RNA(heterogeneous nuclear RNA,hnRNA)。在hnRNA经加工成为成熟mRNA的过程中,需要很多蛋白质的参与。根据结合的RNA种类的不同,这些蛋白可以分作3类:核小核糖核蛋白(snRNP),mRNA蛋白(mRNP)和核内不均一性核糖核蛋白(heterogeneous nuclearribonucleoprotein,hnRNP)。研究发现,hnRNP家族中的各成员在DNA损伤修复、转录、hnRNA剪接mRNA输送、降解等生物过程中发挥着重要作用。核不均一蛋白L(HnRNPL)是由Pinol-Roma S等在早期转录片段中意外发现的核糖核蛋白,这种蛋白富含胱氨酸及脯氨酸,是核不均一核糖核蛋白(核蛋白)复合体的一个重要组成部分。已知在肺癌中存在,并与肺癌的发生发展有着紧密的关系,同时我们前期的研究已经证实了HnRNP L与生精细胞的增值和凋亡关系密切。hnRNPs家族中的HnRNPK已被报道和前列腺癌有着紧密的关系,并参与前列腺癌的增值、分化以及凋亡过程。我们前期用组织芯片(81点前列腺增生组织及99点前列腺癌组织)进行免疫组化,结果显示,HnRNP L蛋白在前列腺癌中高表达,与文献报道的结果相一致。因此,本课题的设计思路:用HnRNP L慢病毒感染前列腺癌细胞,建立稳定低表达HnRNP L蛋白的前列腺癌细胞株;在此基础上,探导HnRNP L蛋白可能参与的前列腺癌细胞信号通路;并且进行HnRNPL对PC3细胞的生长调控机制的在体研究,揭示HnRNP L参与前列腺癌发生、发展的机制,同时为前列腺癌的治疗提供新的靶点。方法:1、慢病毒转染PC3细胞并且用Western Blot检测转染效果实验分为第一组(阴性对照组:PC3细胞+慢病毒阴性对照),第二组(干扰组:PC3细胞+HnRNP L慢病毒),慢病毒转染PC3细胞72小时后在荧光显微镜下观察其形态、生长状态和转染效率;并且用Western Blot检测HnRNP L蛋白在两组中的表达,检测转染效果。2、慢病毒沉默 HnRNPL 基因对 PC3 细胞 Bcl-2、caspase-3、caspase-9、iNOS、CEACAM1基因表达的影响用Western Blot和RT-PCR检测阴性对照组和干扰组中Bcl-2、caspase-3、caspase-9、iNOS、CEACAM1 表达的变化。3、HnRNPL对PC3细胞的生长调控机制的在体研究用阴性对照组和干扰组细胞分别注射到5只裸鼠皮下,构建前列腺癌裸鼠移植瘤,定期观察裸鼠生长情况及裸鼠皮下肿瘤形成情况,裸鼠饲养至4周时处死,取下肿瘤,制作石蜡切片并进行HE染色,显微镜下观察肿瘤的病理结构。结果:1、慢病毒转染PC3细胞72小时后荧光显微镜白光下观察成上皮细胞形态,生长状态良好。在激发光下,部分PC3细胞能发出绿色荧光,荧光较均匀的分布于整个细胞,慢病毒的转染效率较高。Western blot结果显示,干扰组PC3细胞的HnRNP L蛋白被成功下调,我们成功建立了稳定低表达HnRNPL蛋白的前列腺癌细胞,为后续的实验打下坚实的细胞基础。2、Western blot结果显示,PC3细胞中下调HnRNPL后,Bcl-2表达量没有明显的差异,而激活型caspase-3和激活型caspase-9的表达量升高;RT-PCR结果显示,在下调HnRNP L后,PC3细胞Bcl-2mRNA表达量无明显变化(t=0.063,P=0.956),但是 iNOSmRNA 的表达量显著下调(t=27.152,P=0.001),CEACAM1mRNA 的表达量也显著下降(t=127.891,P=0.000)。3、干扰组和阴性对照组裸鼠分别皮下注射干扰组和阴性对照组PC3细胞,4周后,阴性对照组裸鼠均长出肿瘤,将阴性对照组裸鼠处死,取出移植瘤,而干扰组裸鼠4周内均未长出肿瘤。阴性对照组肿瘤HE染色显示:肿瘤细胞呈无规则分布,细胞体积明显增大,典型的核大浆少且核大小不一,较多病理性核分裂现象,无明显腺体结构存在。结论:1、我们用慢病毒转染的方法成功建立了稳定、高效、均一的低表达HnRNP L蛋白的前列腺癌细胞,为后续的实验打下基础。2、在PC3细胞中下调HnRNP L的表达后,可促进细胞的凋亡,其凋亡增加可能是与 caspase-3、caspase-9、iNOS 及 CEACAM1 通路有关3、下调HnRNPL蛋白的表达可能会有抑制前列腺癌肿瘤形成的作用。