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目的:微小RANs(microRNAs)在肿瘤的发生发展过程中扮演着十分重要的角色,已经被公认是一种具有潜在价值的非侵袭性生物标志物。研究表明,microRNAs的含量在乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌以及多种神经系统疾病患者中呈现明显的上升趋势。因此,对microRNAs的早期、快速、灵敏和特异地检测,成为临床和科研工作者亟需解决的难题。本研究利用DNA纳米技术和碳纳米粒子制备电化学生物传感器对microRNAs进行检测,旨在为临床医生对肿瘤的早期筛查和诊断提供重要依据。方法:1.电化学生物传感器的制备:基于等温目标循环放大和DNA信号转导触发反应构建高灵敏的通用电化学生物传感器;基于点击化学介导的酶辅助目标循环(EATR)和多功能化碳纳米粒子(MFC60)双放大策略构建超灵敏的电化学生物传感器。运用实时荧光技术、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、透射电子显微镜(TEM)、X射线光电子能谱(XPS)和电化学技术等方法对传感器的每一步修饰和纳米材料的合成进行验证和表征。2.MFC60的合成:用溶剂交换法制备富勒烯(C60)的水溶液;利用超分子化学合成同时具有氨基(-NH2)和巯基(-SH)修饰的MFC60。3.电化学生物传感器的可行性验证及实验条件的优化:用电化学方法验证传感器的可行性;优化捕获探针的序列、捕获探针的固定时间、核酸链的反应比例、叠氮链和炔氢链的序列等实验条件。4.传感器分析性能的评价及样本的检测:合理评价两种传感器的分析性能,如线性范围、最低检测限、特异性、重复性和稳定性等;将待测样本中目标物的信号转化为可以检测的电化学信号进行分析。结果:1.用多种方法对制备的两种电化学生物传感器和碳纳米材料进行表征和验证,结果表明传感器的制备和材料的合成均是成功的。2.基于等温目标循环放大和DNA信号转导触发反应构建的通用电化学生物传感器,其各项性能:可高灵敏地检测micro RNA-21;检测线性范围为0.5-2000 p M;最低检测限为56 f M;特异性、重复性和稳定性良好。3.基于点击化学介导的EATR和MFC60双重放大策略构建的电化学生物传感器,其各项性能:通过双重放大策略,本方法能超灵敏地检测micro RNA-141;检测的线性范围为0.1 p M到100 n M;最低检测限为7.78 f M;拥有良好的特异性、重复性和稳定性。结论:本研究分别应用等温目标循环反应耦合DNA信号转导和点击化学介导的酶辅助目标循环结合多功能化碳纳米粒子构建用于microRNAs检测的电化学生物传感器。两种传感器分别应用于mi RNA-21的检测和mi RNA-141的检测。在不同的信号放大技术下,均展现出对microRNAs的高灵敏分析性能。同时,运用多种技术对合成的纳米材料和制备的传感器进行表征,结果表明纳米材料的成功合成和传感器的成功制备。值得注意的是,两种传感器平台都可以通过改变捕获探针的相应序列,实现对其它核酸的检测;基于点击化学构建的传感器还可以用于对铜离子浓度的检测。因此,本研究制备的电化学生物传感器因其良好的分析性能,在核酸分析领域中具有巨大的应用前景。