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第1部分:miR-124-3p、miR-506-3p在肝癌及癌旁组织中的表达及对患者预后评估研究研究背景和目的:肝细胞癌（Hepatocellullar carcinoma,HCC）,简称肝癌,是全球第五大常见癌症,每年约有78万人死于肝癌,占所有癌症死亡人数的9%左右。在我国,大多数的肝癌患者有感染乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒的病史,同时二者亦是肝癌发生及发展的主要危险因素之一。肝癌的发病率和死亡率均较高,其复发和转移依然是影响肝癌患者生存率的主要原因。因而阐明肝癌发生和发展的潜在分子生物学机制将有助于确定新型的标志物并制定有效的治疗策略。本部分论文首先开展了临床研究,充分探究了miR-124-3p、miR-506-3p及SIRT1在肝癌及癌旁组织中的表达以及对患者预后评估价值的影响,同时确定了肝癌发展过程中miR-124-3p、miR-506-3p及SIRT1三者之间的相关性,为下文的机制探究提供基础。材料与方法:选取62例肝癌组织及癌旁组织,RT-PCR检测两种组织内miR-124-3p及miR-506-3p的表达量;免疫组织化学染色分析SIRT1的蛋白表达;确定miR-124-3p、miR-506-3p及SIRT1的表达与肝癌患者临床病理学关系;miR-124-3p、miR-506-3p及SIRT1的表达对肝癌患者预后价值评估;Pearson分析miR-124-3p、miR-506-3p与SIRT1蛋白的表达相关性。结果:RT-PCR分析:miR-506-3p及miR-124-3p的表达体现出相同的趋势,肝癌组织内的表达低于癌旁组织,对比差异显著（P＜0.05）;免疫组化分析:SIRT1在肝癌组织内表达上调,对比差异显著（P＜0.05）;miR-124-3p、miR-506-3p、SIRT1表达与临床病理学资料分析:miR-124-3p、miR-506-3p、SIRT1的表达与患者年龄及性别关联性小,差异无统计学意义（P＞0.05）;随着肿瘤大小、TNM分期及分化程度的增加,miR-124-3p、miR-506-3p的表达体现出降低的趋势,而SIRT1的表达呈现出上升趋势,对比差异显著（P＜0.05）;miR-124-3p、miR-506-3p及SIRT1的表达与患者生存期的相关性:miR-124-3p、miR-506-3p低表达组患者的生存期低于miR-124-3p、miR-506-3p高表达组,二者的中位生存期分别为（31.27±3.45）/（46.88±3.90）月,（23.80±2.25）/（41.75±2.83）月,对比差异显著（P＜0.001）;SIRT1高表达组患者的生存期低于SIRT1低表达组,二者的中位生存期分别为（35.60±3.29）月与（41.23±2.75）月,对比差异显著（P=0.005）。癌组织内miR-124-3p、miR-506-3p的表达与SIRT1的表达相关性:随着SIRT1在肝癌组织内表达增加,miR-124-3p及miR-506-3p的表达均呈现出下降的趋势,相关性系数分别为r=-0.382及-0.543,对比差异显著（P＜0.05）。结论:（1）肝癌组织内,miR-124-3p及miR-506-3p呈现出低表达趋势,抑癌性明显,SIRT1呈现出高表达趋势,促癌性明显。（2）miR-124-3p、miR-506-3p的表达与SIRT1的表达具有一定的负相关性,对患者预后均具有一定的评估价值,miR-124-3p、miR-506-3p的低表达或SIRT1的高表达均可以明显缩短患者的生存周期,给予临床一定参考。第2部分:miR-124-3p联合miR-506-3p靶向SIRT1抑制肝癌发展机制体外细胞学研究研究背景和目的:肿瘤的迁移和侵袭是一个多步骤多阶段的进展过程,经历了早期原位癌及肿瘤内血管的不断生长、肿瘤细胞的变形脱落逐渐迁移到机体的各个系统中,比如进入到血管及淋巴管系统,形成微小的癌栓,在临近的其他组织器官中定位生长,为后期的转移和扩散提供基础。在肿瘤细胞的转移和侵袭过程中,需要两个条件的改变:一是肿瘤微环境的改变,包括肿瘤周围新生的毛细血管以及细胞外基质的破坏和降解;另一个是肿瘤细胞自身的变化,如肿瘤细胞上皮-间质转化（EMT）等。如需抑制肿瘤的发生及发展过程,需要对其增殖、迁移及侵袭能力进行有效的控制。miRNAs参与了对肿瘤细胞迁移、侵袭及转移活动的关键调控。经过第一部分的研究我们已经得知:在肝癌的病理发展过程中,miR-124-3p和miR-506-3p在癌组织内表达降低,SIRT1表达增加,同时miR-124-3p、miR-506-3p、SIRT1的表达与肝癌患者的预后具有相关性,提示上述三种分子具有作为评估肝癌预后生物标志物的潜能。但是三者在调控肝癌病理学发展过程中具体分子机制尚不明确,由此我们推想在肝癌发展过程中,miR-124-3p和miR-506-3p对SIRT1是否具有一定的调控机制,miR-124-3p和miR-506-3p二者之间的作用性如何?是单独发挥作用亦或是具有协同性?为此我们开展了体外研究,从体外细胞模型的角度探究miR-124-3p联合miR-506-3p靶向SIRT1抑制肝癌细胞生物活性的病理机制,并分析miR-124-3p联合miR-506-3p在抑制肝癌病理性发展过程中的协同效应。材料与方法:选取人正常肝细胞系HL7702、肝癌细胞系Hep G2、Huh7、MHCC97H、SK-Hep-1和SMMC7721作为研究对象,原代培养,第三代单层细胞作为研究对象。RT-PCR检测上述各组细胞内miR-124-3p及miR-506-3p的表达量;Western-blot检测各组细胞内SIRT1的表达;双荧光素酶基因检测系统确定miR-124-3p、miR-506-3p及二者结合对SIRT1的靶向调控性;细胞内转染miR-124-3p、miR-506-3p过表达质粒,RT-PCR检测各组细胞内SIRT1表达,确定三者之间的靶向关系;细胞内进行SIRT1沉默处理,检测各组细胞的增殖、凋亡、迁移及侵袭能力;细胞内转染miR-124-3p、miR-506-3p过表达质粒,检测各组细胞的增殖、凋亡、迁移及侵袭能力。结果:SIRT1表达对肝癌细胞生物活性影响分析:Western-blot显示正常肝细胞系HL7702内SIRT1表达最低,各组肝癌细胞系内SIRT1的表达增高,其中Hep G2以及SMMC7721细胞系体现出最高的SIRT1表达,对比差异显著（P＜0.05）;各组细胞系内SIRT1沉默表达:（1）CCK-8检测细胞增殖活性:随着SIRT1在细胞内沉默表达,细胞在各个时间段的增殖活性明显降低,其中细胞培养48小时及72小时的增殖速率同初始时刻相比,对比差异显著（P＜0.05）;（2）TUNEL检测细胞凋亡性:当SIRT1在细胞内沉默表达后,细胞的凋亡性增加,对比差异显著（P＜0.05）;（3）划痕及Transwell检测:Hep G2以及SMMC7721细胞系的迁移及侵袭体现出相同的趋势;当SIRT1在细胞内沉默表达后,细胞的迁移及侵袭性能明显降低,对比差异显著（P＜0.05）。双荧光素酶基因检测分析miR-124-3p和miR-506-3p对SIRT1靶向性:miR-124-3p、miR-506-3p的m RNA 3’非编码区预测到SIRT1的结合位点;靶向关系验证:当WT-SIRT1质粒与miR-124-3p或miR-506-3p模拟物共转染时,与对照组相比,Hep G2和SMMC7721细胞中的荧光素酶活性显著降低;与miR-124-3p或miR-506-3p模拟转染相比,WT-SIRT1质粒与miR-124-3p+miR-506-3p共转染模拟物相结合时,荧光素酶活性进一步降低,对比差异显著（P＜0.05）;转染miR-124-3p或miR-506-3p模拟物的Hep G2和SMMC7721细胞严重抑制SIRT1蛋白的表达。与miR-124-3p或miR-506-3p单独模拟转染相比,miR-124-3p结合miR-506-3p共转染可显著抑制Hep G2和SMMC7721细胞中SIRT1蛋白的表达,对比差异显著（P＜0.05）。miR-124-3p、miR-506-3p靶向SIRT1抑制肝癌细胞生物活性:RT-PCR检测:各组细胞内miR-124-3p、miR-506-3p得到成功的过表达,对比差异显著（P＜0.05）;CCK-8检测:CCK-8检测各组细胞增殖活性Hep G2和SMMC7721细胞系体现出相同趋势,当miR-124-3p或miR-506-3p在肝癌细胞内过表达后,细胞的增殖活性降低,而当miR-124-3p及miR-506-3p共转染后,活性进一步降低,体现出协同的特性,SIRT1的加入提升细胞的增殖活性,对比差异显著（P＜0.05）;TUNEL检测:当miR-124-3p或miR-506-3p在肝癌细胞内过表达后,细胞的凋亡性提升,当miR-124-3p及miR-506-3p共转染后,细胞的凋亡性进一步提升,SIRT1的加入降低肝癌细胞的凋亡活性,对比差异显著（P＜0.05）;划痕实验及Transwell检测:当miR-124-3p或miR-506-3p在肝癌细胞内过表达后,细胞的迁移及侵袭性能降低,当miR-124-3p及miR-506-3p共转染后,迁移及侵袭性能进一步降低,体现出协同特性,SIRT1的加入可以提升肝癌细胞的迁移及侵袭性能,对比差异显著（P＜0.05）。结论:（1）在肝癌发生发展过程中,miR-124-3p及miR-506-3p体现出协同性;二者共同抑制靶点SIRT1的活性,最终对肝癌细胞的生物学活性进行调控。（2）当miR-124-3p及miR-506-3p在肝癌细胞内过表达后,SIRT1活性降低,进而抑制肝癌细胞的增殖、迁移及侵袭性能,促进其凋亡性,最终抑制肝癌的发展。第3部分:miR-124-3p联合miR-506-3p靶向SIRT1抑制肝癌发展机制裸鼠成瘤实验研究研究背景:肿瘤是机体细胞异常增殖所形成的新生物,其发病机制较为复杂,肿瘤的形成过程是细胞生长、增殖调控紊乱的结果,而肿瘤的侵袭及转移亦是恶性肿瘤的重要生物学特征,亦是引起恶性肿瘤患者死亡的首要因素[1,2]。研究指出[3,4],肿瘤的侵袭和转移是一个多因素调控、多步骤参与的复杂过程,涉及肿瘤细胞从原发灶游出、突破基底膜、穿过细胞间质、进入血管或淋巴管、迁移到远处,最后定植生长等重要步骤,多种基因的相互作用共同形成了复杂的分子生物学网络。因此可以看出,肿瘤的异质性是导致其出现远处转移的原因[5,6]。大多数的抗癌药物在临床实验中失败,其中一个比较重要的因素是它们的临床模型不能很好的反应肿瘤微环境的真实性,因而在肝癌病理机制探究上需要依赖实验动物模型来实现[7,8]。目的:在上述两部分的研究基础上,我们从体内动物模型的角度探究miR-124-3p联合miR-506-3p靶向SIRT1抑制肝癌细胞生物活性的病理机制,确定miR-124-3p联合miR-506-3p在抑制肝癌病理发展中的协同效应,给予临床一定的启发。材料与方法:选取Hep G2和SMMC7721作为研究对象,细胞内转染miR-124-3p、miR-506-3p的过表达质粒,设置miR-124-3p及miR-506-3p共转染组;选取BALB/c裸鼠作为研究对象,皮下接种肝癌细胞;裸鼠继续饲养5周,对其生活状态、瘤体的生长趋势进行数据分析,确定在肝癌病理发展中miR-124-3p、miR-506-3p的协同性作用以及对SIRT1的抑制作用。结果:各组小鼠肿瘤体积变化趋势:随着接种时间的延长,各组小鼠的肿瘤体积均体现出增加的趋势,当肝癌细胞内miR-124-3p或miR-506-3p过表达后,小鼠的瘤体体积增长趋势变缓,miR-124-3p及miR-506-3p共转染后,小鼠的瘤体体积增长趋势进一步变缓,对比差异显著（P＜0.05）。小鼠肿瘤质量趋势变化:随着接种后时间的延长,肿瘤质量均体现出增加的趋势,当肝癌细胞内miR-124-3p或miR-506-3p过表达后,小鼠的瘤体质量增长趋势变缓,miR-124-3p及miR-506-3p共转染后,小鼠的瘤体质量增长趋势进一步变缓,对比差异显著（P＜0.05）;Western-blot检测SIRT1蛋白表达:当肝癌细胞内miR-124-3p或miR-506-3p过表达后,瘤体内SIRT1浓度表达降低,miR-124-3p及miR-506-3p共转染后,SIRT1浓度表达进一步降低,对比差异显著（P＜0.05）。结论:在肝癌病理发展过程中,miR-124-3p及miR-506-3p协同抑制SIRT1的表达活性,充分抑制裸鼠瘤体的生长趋势,最终抑制肝癌的发展,为临床表观遗传学探究肝癌的病理发展机制提供理论基础。